張永改，郭 敏，張大山，劉偉蘭，李祥龍*，周榮艷，李蘭會(huì)

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066004；2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)；3 河北省定州市第二中學(xué))

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山羊Agouti基因啟動(dòng)子活性區(qū)域探究

張永改1,2,3，郭 敏1，張大山1，劉偉蘭2，李祥龍1*，周榮艷2，李蘭會(huì)2

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066004；2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)；3 河北省定州市第二中學(xué))

對(duì)前期拼接獲得的12 847 bp山羊Agouti基因序列(EF587236和JN651404)進(jìn)行啟動(dòng)子活性區(qū)域預(yù)測(cè)，確定候選啟動(dòng)子區(qū)為6 450～7 100 bp，得到一個(gè)長(zhǎng)度為2 537 bp的DNA片段，在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)典型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)TATA框，并預(yù)測(cè)到HSF，SYR，GATA-1，Nkx-2，ADR1等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；山羊基因組序列(登錄號(hào)：AJPT01136617.1)中有兩段序列與牛的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子promoter A和promoter B同源性較高，據(jù)此設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段，同時(shí)構(gòu)建12個(gè)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人皮膚黑素瘤細(xì)胞A375和293T細(xì)胞檢測(cè)目的片段是否具有Agouti基因啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，所構(gòu)建的目的片段質(zhì)粒與陰性對(duì)照相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明所獲得的目的片段不具有啟動(dòng)子活性。

山羊；Agouti基因；啟動(dòng)子

Agouti是指被毛具有黑色底色，尖端呈黃色特征皮毛的刺豚鼠，該詞來(lái)源于南美土著印第安部落，最初將與此被毛特征相關(guān)的基因座命名為Agouti[1]，現(xiàn)在動(dòng)物毛色已成為辨別其外貌的主要特征之一[2]。Agouti是黑素皮質(zhì)素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控基因之一，在人(Homosapiens)、雞(Gallusgallus)、牛(Bostaurus)、豬(Susscrofa)、綿羊(Ovisaries)和嚙齒類等許多動(dòng)物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[3～5]。Agouti基因含有多個(gè)等位基因，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并且在不同物種中具有較高的同源性。山羊Agouti基因包含內(nèi)含子1(531 bp)、外顯子2(169 bp)、內(nèi)含子2(1 318 bp)、外顯子3(3 463 bp)和外顯子4(177 bp)[6～8]。采用熒光定量PCR技術(shù)證明，不同毛色山羊皮膚組織中Agouti基因mRNA表達(dá)量為白色>黑色>棕色山羊，說(shuō)明不同毛色山羊皮膚組織中的mRNA表達(dá)量不同，5’UTR變異對(duì)不同毛色山羊Agouti基因mRNA表達(dá)量有影響[9]。在所獲得的山羊Agouti基因12 847 bp序列中對(duì)基因編碼區(qū)上游進(jìn)行啟動(dòng)子活性區(qū)域預(yù)測(cè)，利用TFSEARCH軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，檢測(cè)到GATA-2，GATA-3，Oct-1，CdxA，HSF，GATA-1，STRE，ADR1，AP-2和AP-1等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，確定候選啟動(dòng)子區(qū)為6 450～7 100 bp[10]。尋找Agouti基因啟動(dòng)子區(qū)域是研究Agouti基因重要環(huán)節(jié)，該工作對(duì)研究該基因遺傳的分子生物學(xué)基礎(chǔ)、指導(dǎo)山羊品種改良、選育及品種特異性研究具備重要理論和實(shí)踐意義，同時(shí)能為我國(guó)地方山羊品種群體遺傳的結(jié)構(gòu)、分化及其多樣性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本次試驗(yàn)所用樣品來(lái)自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的太行山羊肝臟組織樣品，利用酚氯仿抽提法提取山羊肝臟組織基因組DNA。PCR擴(kuò)增、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染等所用試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 目的片段引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

利用Primer Premier 5.0軟件，對(duì)擴(kuò)增的2 537 bp序列分別設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的缺失片段，構(gòu)建12個(gè)含有該片段的質(zhì)粒(表1，分別以片段的起止位置命名)。在全長(zhǎng)2 537 bp片段中不包含KpnⅠ，SmaⅠ，HindⅢ酶切位點(diǎn)，上述3種酶的酶切位點(diǎn)可作為參考的限制性酶切位點(diǎn)。在正反向引物的5’端分別引入KpnⅠ，SmaⅠ，HindⅢ酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基以便于克隆。

PCR反應(yīng)總體系為40 μL：滅菌水12 μL，2×Taq Mastermix 20 μL，模板基因組、cDNA 2 μL和正反引物各3 μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ℃,5 min；變性，94 ℃，30 s；退火30 s；延伸，72 ℃，根據(jù)片段大小確定延伸時(shí)間，35個(gè)循環(huán)；終延伸，72 ℃，10 min。

表1 擴(kuò)增山羊Agouti 基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)區(qū)序列引物

注：小寫字母為引入的保護(hù)堿基，下劃線處為限制性酶切位點(diǎn)；大寫字母為引物特異性序列。

1.3 目的片段的克隆及鑒定

連接pMD-19T載體體系：0.5 μL PMD-19T vector，0.5～2.0 μL PCR回收產(chǎn)物，2.5 μL Slution I ，滅菌的去離子水補(bǔ)齊到5 μL。然后離心混勻，16 ℃連接過夜然后用TransⅠ-T1感受態(tài)轉(zhuǎn)化。過夜37 ℃搖床培養(yǎng)，利用通用引物，吸取1 μL菌液為模板做菌液PCR鑒定，選取陽(yáng)性克隆，送華大基因公司測(cè)序鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

以回收的目的片段和酶切后的pGL3-Basic載體10∶1比例連接，用T4 DNA連接酶將目的片段連接到pGL3-basic載體上，構(gòu)建含熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒。菌液PCR鑒定后選陽(yáng)性克隆，雙酶切鑒定后華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及檢測(cè)

在24孔培養(yǎng)板用胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為0.10的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞和A375細(xì)胞。培養(yǎng)條件為： CO2的體積分?jǐn)?shù)為0.05，37 ℃溫箱培養(yǎng)，24 h后當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)， 再根據(jù)Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，最后輕輕晃動(dòng)孔板使之混勻，放入CO2的體積分?jǐn)?shù)為0.05，37 ℃溫箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后，用相應(yīng)的含血清的正常細(xì)胞培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞。用1×PBS洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞1～2次，加入報(bào)告基因細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞和熒光劑用于檢測(cè)。

圖1 山羊基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊基因組DNA的提取結(jié)果

提取的DNA條帶致密、整齊、清晰，并且無(wú)明顯拖尾(圖1)，說(shuō)明DNA完整性較好，不需要純化，可稀釋后直接做模板進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2 目的片段啟動(dòng)子區(qū)活性驗(yàn)證

2.2.1 目的片段序列比對(duì)及擴(kuò)增結(jié)果 目的片段A和B與云南黑山羊Agouti基因部分序列(登錄號(hào)為AJPT01136617.1)同源性分別達(dá)92%和94%，其他片段同源性100%。利用模山羊基因組，TransStart Taq酶及引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，質(zhì)量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約750，2 500 bp處有明亮條帶(圖2)。

圖2 山羊Agouti基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)區(qū) PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 重組質(zhì)粒pMD19-T/2537/A/B的PCR鑒定與雙酶切鑒定 利用重組質(zhì)粒pMD19-T/2537和pMD19-T-A以及pMD19-T-B為模板，NS0和NA0為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。質(zhì)量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約2 500，750 bp處有明亮條帶(圖3)。

利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和KpnⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T/2537和pMD19-T-A,pMD19-T-B進(jìn)行雙酶切，質(zhì)量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖4)。

2.2.3 重組質(zhì)粒pGL3-Basic/px/A/B的PCR與雙酶切鑒定 利用重組質(zhì)粒pGL3-Basic/px/A/B為模板及相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，質(zhì)量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果圖譜為圖5，雙酶切電泳結(jié)果見圖6。

2.2.4 測(cè)序鑒定 將上述經(jīng)PCR和酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pGL3-Basic/px/A/B送北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，克隆到的目的片段與pGL3-Basic/px中所得山羊Agouti基因序列相似性高達(dá)90%以上，表明已成功構(gòu)建了12個(gè)包含山羊Agouti基因重組質(zhì)粒。

2.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及目的片段啟動(dòng)子活性鑒定 對(duì)A375細(xì)胞和293T細(xì)胞分別進(jìn)行綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明，在m(脂質(zhì)體)∶m(質(zhì)?？偭?為1∶1時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，約為85%(圖7，圖8)，不同轉(zhuǎn)染比例的結(jié)果見表2。

圖3 重組質(zhì)粒pMD19-T-2537和pMD-T-A，pMD-T-B的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖4 質(zhì)粒pMD19-T/2537和pMD-T-A，pMD-T-B雙酶切電泳圖

圖5 重組質(zhì)粒pGL3-Basic/px/A/B PCR產(chǎn)物電泳圖

圖6 重組質(zhì)粒pGL3-Basic/px/A/B雙酶切電泳圖

圖7 A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白 圖8 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在m(脂質(zhì)體)∶m(質(zhì)?？偭?為1∶1時(shí)，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因兩種質(zhì)粒最佳比例的探索，結(jié)果表明，A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL-3 Control和pRL-TK最佳比例為100∶1，293T細(xì)胞的最佳比例為800∶1(圖9)。

根據(jù)所探索的最佳轉(zhuǎn)染效率結(jié)果，轉(zhuǎn)染體系見表3。

報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞及293T細(xì)胞。48 h后收獲細(xì)胞并裂解細(xì)胞，計(jì)算相對(duì)Luc活性值。綜合多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,A375細(xì)胞和293T細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照Luc值遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照，說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效果比較好，陰性對(duì)照與pGL3-Basic/px/A/B的Luc值相比差異不顯著(p>0.05),說(shuō)明pGL3-Basic/px/A/B均不具備啟動(dòng)子活性(表4)。

表2 不同lip和GFP質(zhì)粒比例對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響 %

圖9 不同pGL-3 Control和pRL-TK比例的Luc相對(duì)活性值

表3 A375和293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系

表4 A375和293T細(xì)胞中片段pGL3-Basic/px/A/B的Luc活性比值

3 討 論

實(shí)驗(yàn)室前期所測(cè)山羊Agouti基因部分序列(EF587236.2)與(JN651404)拼接序列長(zhǎng)度為12 847 bp，預(yù)測(cè)出山羊Agouti基因候選啟動(dòng)子區(qū)為6 450～7 100 bp。將綿羊CH243-455O4的反向互補(bǔ)序列與12 847 bp(EF587236+JN651404)的拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得12 847 bp序列之前的部分序列，拼接后得到長(zhǎng)度為27 793 bp的山羊Agouti基因部分基因組序列。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這條長(zhǎng)達(dá)27 793 bp的基因序列與NCBI中部分山羊Agouti基因片段(登錄號(hào)為AJPT01136619.1，AJPT011366120.1，AJPT01136621.1，AJPT01136622.1，AJPT01136623.1)的部分序列都能比對(duì)上，并可以形成連續(xù)的片段。通過本次實(shí)驗(yàn)中所獲得的片段，將山羊基因組片段(登錄號(hào)為AJPT01136617.1，AJPT011366118.1，AJPT011366119.1)的所有序列拼接起來(lái)，直到與前期獲得的27 793 bp片段有重合部分，這樣就獲得與27 793 bp拼接序列共36 067 bp，再加上之前的27 793 bp共63 860 bp，這樣從所得的63 860 bp的序列來(lái)看，前期選取的候選啟動(dòng)子區(qū)域范圍為56 180～58 717 bp，這2 537 bp的候選區(qū)域包括了Agouti基因外顯子2的前44 bp。根據(jù)Michael等[11]對(duì)牛的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子片段promoter A和promoter B與山羊基因組序列(登錄號(hào)為AJPT01136617.1)比對(duì)，結(jié)果：promoter A與山羊基因組序列(登錄號(hào)為AJPT01136617.1)1 472～2 011 bp位置相對(duì)應(yīng)。Promoter B與山羊基因組序列(登錄號(hào)為AJPT01136617.1)3 068～3 632 bp位置相對(duì)應(yīng)，但是promoter B的前100 bp沒有比對(duì)上。通過實(shí)驗(yàn)構(gòu)建所獲得的目的片段重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果為：所獲得目的片段均無(wú)啟動(dòng)子活性。從本次實(shí)驗(yàn)所選取的區(qū)域與實(shí)驗(yàn)室前期所選取的區(qū)域中間有16 481 bp。經(jīng)過試驗(yàn)探索，接下來(lái)的工作可以從以下兩方面進(jìn)行：在這16 481 bp范圍內(nèi)，以2 000 bp為一個(gè)片段，可以逐段預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果并進(jìn)行blast比對(duì)，來(lái)尋找一段保守性強(qiáng)，并且預(yù)測(cè)值高的片段進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)尋找；根據(jù)前期課題組對(duì)5’非翻譯區(qū)外顯子1剪接體類型的研究，根據(jù)各種類型剪接體在基因組的相對(duì)位置，找到最靠近5’端剪接體之前的序列，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子活性并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證；基于Norris等[12]對(duì)白色綿羊的ITCH啟動(dòng)子控制ASIP的表達(dá)的研究來(lái)設(shè)計(jì)引物，對(duì)其試驗(yàn)驗(yàn)證。

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Explore of Promoter Activity Area of GoatAgoutiGene

ZHANG Yong-gai1,2,3,GUO Min1,ZHANG Da-shan1,LIU Wei-lan2, LI Xiang-long1,ZHOU Rong-yan2,LI Lan-hui2
(1 Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao Hebei,066004;2 Agricultural University of Hebei;3 Dingzhou Second Middle School;China)

The candidate promoter region (6 450-7 100 bp) of goatAgoutigene was predicted using the sequence joined from JN651404 and EF587236.2. The fragment of 2 537 bp was obtained, in which a typical transcription factor binding sites of TATA box was found, and other transcription factor binding sites (HSF, SYR, GATA-1, ADR1 and Nkx-2) were also predicted. Twelve luciferase reporter gene plasmids were constructed based on two parts of goat genome sequence of AJPT01136617.1 which had higher homology with cattle predicted promoters A and B. Then luciferase reporter gene plasmids were transiently transfected into cells of A375 and 293T to determine whether the fragments hadAgoutigene promoter activity. The results showed that the constructed plasmids had no significant difference compared with negative control, indicating the fragments had no promoter activity.

goat;Agoutigene;promoter

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：31172196)；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：15962901D)。

，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：動(dòng)物遺傳育種。E-mail：lixianglongcn@yahoo.com。

2015-09-15

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.001

S827.2

A

1672-7983(2015)03-0001-07

張永改(1987-)，女，碩士。主要研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)。

(責(zé)任編輯：朱寶昌)