李艷云，史秋梅，王曉珊，盧會鵬，高光平，張艷英，高桂生，趙惠媛，沈 萍

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

?

紫錐菊多糖對內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥的保護作用

李艷云，史秋梅，王曉珊，盧會鵬，高光平，張艷英，高桂生，趙惠媛，沈 萍

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

為確定紫錐菊多糖對內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥反應(yīng)的保護作用，將100只BALB/c小鼠隨機分成正常組，模型組，紫錐菊多糖高、中、低劑量組(分別為2.0，1.0，0.5 g/kg)，每組20只。模型組、紫錐菊多糖各組小鼠通過腹腔注射脂多糖(8 mg/kg)造模，正常組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。紫錐菊多糖分別于造模前灌胃給藥 5 次(間隔 24 h)并在造模后持續(xù)給藥2次(間隔 24 h)；正常組和模型組小鼠只灌服等體積生理鹽水。各實驗組小鼠分別于造模后1，6，24，48 h剖殺，ELISA法檢測血清中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β( Interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6 ( Interleukin-6，IL-6)的濃度和肺臟組織的濕質(zhì)量/干質(zhì)量值。結(jié)果表明：紫錐菊多糖組小鼠的血清中TNF-α，IL-1β，IL-6濃度明顯低于模型組(P<0.05)，肺臟組織的濕質(zhì)量/干質(zhì)量值明顯低于模型組(P<0.05)，且紫錐菊多糖高劑量組小鼠的效果最好。因此，紫錐菊多糖能夠為內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥提供保護作用。

紫錐菊；內(nèi)毒素血癥；腫瘤壞死因子；白細(xì)胞介素

紫錐菊是原產(chǎn)于美洲的一類菊科野生花卉，是世界聞名的“免疫”草藥，紫錐菊屬 (EchinaceapurpureaMoenck )植物共有8個種及數(shù)個變種，均為多年生草本，其中紫錐菊Echinaceapurpurea、狹葉紫錐菊Echinaceaaugustifolia和白紫錐菊Echinaceapallida可作為藥用。此3種紫錐菊提取物具有突出的抗感染與免疫促進作用，由其組成的各種制劑是當(dāng)前國際上廣泛應(yīng)用的免疫促進劑。研究表明，紫錐菊可通過刺激機體的免疫系統(tǒng)而增強機體對細(xì)菌和病毒感染的抵抗力[1]。

筆者通過對內(nèi)毒素血癥小鼠模型炎癥反應(yīng)的研究，探討紫錐菊提取物能否為內(nèi)毒素血癥小鼠提供保護作用，從而為畜禽生產(chǎn)中對抗內(nèi)毒素血癥提供可行性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

6～8周齡20～25 g的BALB/c小鼠引自北京實驗動物研究中心，紫錐菊多糖(多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.94，紫錐菊多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04，菊苣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02)引自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，LPS (脂多糖、內(nèi)毒素)(E.ColiO55:B5，貨號L6529，Sigma產(chǎn)品，引自上海前塵生物科技有限公司， 小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒引自上海巧伊生物科技有限公司。

1.2 分組及造模

將BALB/C小鼠100只，分別隨機分成正常組，模型組，紫錐菊多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組等共5組，每組20只，均為公母各半，飼養(yǎng)于干燥、通風(fēng)、安靜的環(huán)境，自由飲水，飼料喂養(yǎng)。實驗開始前，在實驗環(huán)境中飼養(yǎng)1 周。將紫錐菊多糖稀釋成合適濃度，使紫錐菊多糖高、中、低藥物組每只小鼠灌服紫錐菊的總量為2.0，1.0，0.5 g/kg。模型組、紫錐菊多糖組小鼠通過腹腔注射 LPS(8 mg/kg)造模，正常組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。紫錐菊多糖各組小鼠分別于造模前灌胃給予紫錐菊多糖5次(間隔24 h)，并在造模后持續(xù)給予紫錐菊多糖2次(間隔24 h)；正常組和模型組小鼠只灌服等體積生理鹽水。各實驗組小鼠分別在造模后1，6，24，48 h剖殺，不同時間點每組每次5只。

1.3 血清細(xì)胞因子檢測

摘眼球取血，血液經(jīng)自然凝固后，3 000 r/min離心15 min，分離血清。嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測血清中的細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6的質(zhì)量濃度。

1.4 肺臟組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量值的檢測

頸椎脫臼處死小鼠后，迅速剖開取出完整的一片肺葉，用PBS清洗2次，并用濾紙小心吸干表面水分后稱量其濕質(zhì)量。然后放置在70 ℃恒溫箱中烘干48 h至恒質(zhì)量后，稱量其干質(zhì)量，計算濕質(zhì)量/干質(zhì)量值，該比值代表了肺臟的水含量，以此衡量肺臟的水腫情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中TNF-α，IL-1β，IL-6細(xì)胞因子的檢測結(jié)果

LPS注射后的各個時間點中，模型組小鼠的TNF-α，IL-1β，IL-6質(zhì)量濃度都顯著高于正常組的(P<0.05)，也顯著高于紫錐菊多糖各個劑量組的(P<0.05)(圖1～圖3)。紫錐菊多糖各組小鼠的TNF-α，IL-1β，IL-6質(zhì)量濃度與正常組的相比，低劑量組小鼠在1，6，24 h時間點上，這3種細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度均顯著高于正常組小鼠的(P<0.05)，在48 h時間點上與正常組小鼠的差異不顯著(P>0.05)；中劑量組小鼠的3種細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度在1，6 h時間點上與正常組小鼠的差異均顯著(P<0.05)；而在24 h時間點上，除IL-1β的質(zhì)量濃度與正常組小鼠的差異顯著(P<0.05)外， TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度與正常組小鼠的差異不顯著(P>0.05)；而高劑量組小鼠在各個時間點，這3種細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度與正常組小鼠的相比差異均不顯著(P>0.05)。由此可見，紫錐菊多糖高劑量組在炎癥前期就能顯著抑制這些細(xì)胞因子，紫錐菊多糖中、低劑量組前期的效果不大明顯，48 h時也能顯著抑制這些細(xì)胞因子。

圖2 LPS注射后小鼠血清中IL-6的質(zhì)量濃度 圖3 LPS注射后小鼠血清中IL-1β的質(zhì)量濃度

2.2 肺臟組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量值的測定結(jié)果

在各時間點，與正常組小鼠相比，模型組小鼠肺臟水腫程度均顯著升高(P<0.05)(表1)；紫錐菊多糖各劑量組小鼠中，低劑量組小鼠在1，6，24 h時間點與正常組小鼠相比水腫程度差異顯著(P<0.05)，中劑量組小鼠在6，24 h時間點與正常組小鼠相比水腫程度差異顯著，而在48 h時低劑量組小鼠和中劑量組小鼠與正常組小鼠相比水腫程度差異均不顯著(P>0.05)，而各時間點高劑量組小鼠與正常組小鼠間水腫程度差異均不顯著(P>0.05)；各時間點紫錐菊多糖各劑量組小鼠與模型組小鼠相比，水腫程度差異均顯著(P<0.05)。實驗結(jié)果表明：模型組小鼠肺臟水腫濕質(zhì)量/干質(zhì)量值明顯高于正常組，而紫錐菊多糖各組小鼠的肺臟水腫程度明顯降低，紫錐菊多糖各劑量組小鼠在每個時間點的測量值都更接近于正常水平，尤其紫錐菊多糖高劑量組小鼠的表現(xiàn)最為明顯，中、低劑量組的效果稍差。由此可知，紫錐菊多糖在高劑量時能夠明顯降低由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺臟水腫的程度。

表1 小鼠肺臟組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量值測定結(jié)果(均數(shù)±方差，n=5)

3 結(jié)論與討論

目前已經(jīng)得到證實，內(nèi)毒素是動物內(nèi)毒素血癥死亡的主要原因[2]。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分，當(dāng)細(xì)菌裂解時LPS被釋放出來。LPS具有很強的致炎作用，可激活多種炎性細(xì)胞，使其釋放各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，而過多的內(nèi)毒素進入血液后形成內(nèi)毒素血癥，進而引起全身性炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)，甚至導(dǎo)致休克及多器官功能障礙綜合癥(MODS)[3]。

動物機體內(nèi)不論是經(jīng)過滴鼻感染，還是經(jīng)注射脂多糖，在受到病原微生物感染后，機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放如 TNF-α，IL-1β，IL-6等促炎癥因子。TNF-α，IL-1β，IL-6是具有多種生物活性的重要前炎癥細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用。這些因子協(xié)助調(diào)節(jié)非特異性免疫反應(yīng)，但當(dāng)這些因子累積產(chǎn)生時，會導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征、嚴(yán)重的組織損傷等[4,5]；過量產(chǎn)生時，就會導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞因子釋放的“級聯(lián)反應(yīng)”，加重細(xì)胞損傷，引發(fā)急性的內(nèi)毒素血癥，從而導(dǎo)致組織破壞、器官衰竭、休克甚至死亡[6,7]。此過程在內(nèi)毒素血癥發(fā)展至SIRS/MODS過程起重要作用[8]，但當(dāng)機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用后，這些因子的濃度又會降低。

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并通過特異性細(xì)胞膜連接受體發(fā)揮作用。巨噬細(xì)胞在LPS的作用下能夠合成并釋放TNF-α等多種細(xì)胞因子[9]。研究顯示，在LPS誘導(dǎo)敗血癥約1 h就會產(chǎn)生TNF-α[10]。炎癥損傷的部位會有大量的TNF-α積聚，說明TNF-α具有很強的促炎作用[11]。同時，它能夠誘導(dǎo)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)常與IL-1β協(xié)同作用[12]。IL-1β是另一重要的促炎因子，由LPS激活的外周血單核細(xì)胞主要分泌IL-1β。它能促使T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖分化以及促發(fā)炎癥和全身反應(yīng)等。IL-6主要來源于血液中活化的單核巨噬細(xì)胞[13]。當(dāng)IL-6 的表達水平處于正常狀態(tài)，它可以抑制巨噬細(xì)胞分泌 TNF-α和IL-1。但在大量脂多糖的刺激下，IL-6 的表達明顯高于機體正常水平，這時，它們不但不能保護機體，反而會加劇炎癥。

本次實驗通過小鼠腹腔注射LPS構(gòu)建內(nèi)毒素血癥模型，研究灌服紫錐菊多糖后，小鼠血清中的炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平和肺臟水腫程度。通過實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，小鼠灌服紫錐菊多糖在2.0 g/kg水平時，能夠明顯抑制這些炎癥因子和肺臟水腫程度；當(dāng)小鼠灌服紫錐菊多糖在1.0 g/kg和0.5 g/kg水平，大約在48 h時，也能明顯抑制這些炎癥因子和肺臟水腫程度。從一定程度上可以說明紫錐菊多糖能夠為患內(nèi)毒素血癥的動物提供保護作用，但是，紫錐菊多糖對內(nèi)毒素血癥的作用機理還需進一步研究。

[1] Percival S S.Use of Echinacea in medicine[J].Biochemical pharmacology,2000,60(2):155-158.

[2] 谷鴻喜，陳錦英.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2003.

[3] 施孟如，南超，徐麗艷，等.TRPV1激活對內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織炎癥損傷的影響及機制[J].中國病理生理雜志，2013，29(12)：2 223-2 228.

[4] Shimazu R,Akashi S,Ogata H,et al.MD-2,a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4[J].Journal of Experimental Medicine,1999,189(11):1 777-1 782.

[5] Hawkins D L,Mackay R J,Mackay S L,et al.Human interleukin-10 suppresses production of inflammatory mediators by LPS-stimulated equine peritoneal macrophages[J].Veterinary Immunology & Immunopathology,1998,66(1):1-10.

[6] Bone R C.The sepsis syndrome:definition and general approach to management[J].Clin Chest Med,1996,17(2):175-181.

[7] Astiz M E,Rackow E C.Septic shock[J].Lancet,1998,351(9 144):1 501-1 505.

[8] 范少光，丁桂鳳.神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)之間相互作用的介導(dǎo)物質(zhì)：共用的生物學(xué)語言[J].生理科學(xué)進展，1995，26(2)：175-183.

[9] 張偉，蔣耀光，李磊.肺泡巨噬細(xì)胞與急性肺損傷[J].創(chuàng)傷外科雜志，2003，5(5)：389-391.

[10] Cohen J.The immunopathogenesis of sepsis[J].Nature,2002,420(6 917):885-891.

[11] Balkwill F.Tumour necrosis factor and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2009,9(5):361-371.

[12] Kolb M,Margetts P J,Anthony D C,et al.Transient expression of IL-1β induced acute lung injury and chronic repair leading to pulmonary fibrosis[J].Journal of Clinical Investigation,2001,107(12):1 529-1 536.

[13] 馬麗梅，鄭春蘭，馬加慶.急性肺損傷與細(xì)胞因子相關(guān)性的研究進展[J].Medical Recapitulate，2009，15 (19)：2 909-2 912.

Protective Effects ofEchinaceapurpureaon Inflammation in Endotoxemia Mice

LI Yan-yun,SHI Qiu-mei,ZHAO Hui-yuan,WANG Xiao-shan,LU Hui-peng,GAO Guang-ping,ZHANG Yan-ying,GAO Gui-sheng, SHEN Ping
(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinghuangdao Hebei,066600,China)

This paper is to study the inflammation protection ofEchinaceapurpureain endotoxemia mice. 100 Balb/c mice were randomly divided into normal group and model group, echinacea high, medium and low dose (2.0,1.0,0.5 g/kg) group,twenty mice for each group. Model group and echinacea purpurea polysaccharide group mice were induced by abdominal cavity injection of endotoxin (8 mg/kg).Normal group mice were injected equal volume physiological saline. Before establishment of the mice model,Echinaceapurpureapolysaccharide group mice were filled the stomach five times before the model and two times after the model(interval 24 h). Normal group and endotoxemia group mice were filled the stomach equal volume physiological saline. The mice were killed after establishment of the mice model on 1,6,24,48 hour. Cytokines of TNF-α,IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. In addition, the proportion of wet wight/dry wight in lung tissue were detected. Results showed that concentration of TNF-α,IL-1β,IL-6 and the proportion of wet wight/dry wight in endotoxemia mice increased significantly than the other group.Echinaceapurpureacan protect the inflammation of endotoxemia mice.

EchinaceapurpureaPolysaccharide; endotoxemia; tumor necrosis factor; interleukin

國家自然科學(xué)基金資助項目(項目編號：31472230)；河北省自然科學(xué)基金資助項目(項目編號：C2014407068)；河北省科技廳科技支撐計劃項目(項目編號：14966610D，12220408D)；石家莊市科技局科技支撐計劃項目(項目編號：131200063A)；河北省教育廳百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃(Ⅱ)項目(項目編號：ZH2011244，Q2012037)。

2015-01-19;修改稿收到日期：2015-06-12

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.002

S816.7

A

1672-7983(2015)03-0008-04

李艷云(1986-)，女，在讀碩士研究生。主要研究方向：動物病原微生物與動物傳染病。

(責(zé)任編輯：朱寶昌)

*通訊作者，女，教授。主要研究方向：動物傳染病學(xué)。E-mail:shiqiumei@126.com。