夏 青 , 王寶杰 劉 梅 蔣克勇 沙玉杰 , 辛 芳 , 王 雷

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

凡納濱對蝦在我國已有多年養(yǎng)殖歷史, 是水產(chǎn)業(yè)重要的支柱產(chǎn)業(yè)之一, 而近年來凡納濱對蝦養(yǎng)殖病害頻發(fā), 與環(huán)境污染、對蝦抗病力下降等因素密切相關(guān), 解決這一問題的途徑之一是開發(fā)新型的功能性飼料。生物飼料一般是指利用基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)配制的新型飼料, 它具有提高飼料效價和利用率、有效節(jié)約資源、減少環(huán)境或水體污染、增強(qiáng)動物免疫抗病力、預(yù)防病害、提高安全性等優(yōu)點(diǎn)。如: 發(fā)酵豆粕、酶制劑、益生菌、生物活性肽和寡糖等。目前, 利用生物技術(shù)原理開發(fā)的對蝦全價生物飼料尚未見報道。

對蝦飼料中主要營養(yǎng)成分一般包括蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物元素等[1-2]。國內(nèi)外很多研究集中針對開發(fā)新型蛋白源, 有關(guān)研究指出酶解蛋白能夠?qū)⒌蛢r值的魚類加工副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為具有極高含量必需氨基酸的促生長及免疫促進(jìn)的生物功能物質(zhì), 可增強(qiáng)魚類溶菌酶活力、增加血清補(bǔ)體及 LgM濃度[3-5]。植物蛋白通過高溫、酶解、發(fā)酵等過程, 改善了其必需氨基酸組成及含量不足,含有較多抗?fàn)I養(yǎng)因子, 適口性不佳等缺點(diǎn)[6]。酵母蛋白已作為一種新型飼料蛋白源替代魚粉用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[7]。

本研究以生物酶解制備小肽、復(fù)合益生菌發(fā)酵植物蛋白、自溶及破壁制備酵母蛋白等新型生物原料配制生物飼料, 并進(jìn)行為期 8周的生產(chǎn)性養(yǎng)殖試驗(yàn), 探究生物飼料對凡納濱對蝦生長、免疫及消化性能的影響, 以期為通過功能性飼料提高凡納濱對蝦抗病力及安全控制對蝦病害提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)飼料

發(fā)酵豆粕是將枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母接種在豆粕中發(fā)酵獲得, 酶解多肽是用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解水產(chǎn)動物加工副產(chǎn)品所得, 破壁酵母是熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母于培養(yǎng)基中發(fā)酵所得發(fā)酵物經(jīng)誘導(dǎo)自溶和破壁處理后所得, 以煙臺大樂公司生產(chǎn)的南美白對蝦飼料作為對照飼料, 將以上三種原料分別替代大樂飼料中一定比例的魚粉、豆粕和飼料酵母, 使其在配方的用量比例分別達(dá)到 8%、10%及 2%, 獲得供試驗(yàn)用的對蝦生物飼料,營養(yǎng)成分分析由中科院海洋所分析測試中心測定,結(jié)果見表1。

表1 生物飼料與普通飼料組分及營養(yǎng)成分分析Tab.1 Proximate and amino acid compositions of treatment-diet and control-diet

1.2 飼養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)于2013年7~8月在山東濱州喬莊鎮(zhèn)倉上村對蝦養(yǎng)殖場進(jìn)行, 該養(yǎng)殖場水源為地下淡水。試驗(yàn)選擇兩口條件相近的池塘, 試驗(yàn)池面積為 1267m2, 對照池面積為 1000m2。每池配備 1.75kW 葉輪式增氧機(jī)一臺。凡納濱對蝦種苗為一代蝦苗, 放養(yǎng)密度為36萬尾/ha。各項(xiàng)管理完全按照生產(chǎn)規(guī)程進(jìn)行。日投餌量為對蝦體質(zhì)量的 2%并根據(jù)天氣及對蝦攝食情況調(diào)整, 每日投喂3次, 分別在6:00、11:00及19:00。每 2日采集水樣進(jìn)行水質(zhì)分析, 現(xiàn)場采用雷磁PHS-3D型便攜式pH計測定pH, 用WYY－便攜式折射鹽度計測量鹽度。用YSI550便攜式溶氧儀測定溶解氧(DO)及水溫, 氨氮采水楊酸分光光度計 HJ 536-2009法國家標(biāo)準(zhǔn)測定; 亞硝酸鹽選用分光光度法GB 7493-87測定。每15d用旋網(wǎng)隨機(jī)取對蝦樣品一次。

1.3 樣品采集及處理

試驗(yàn)?zāi)┢陔S機(jī)取30尾蝦, 測其體質(zhì)量和體長。計算成活率、餌料系數(shù)。計算公式:

成活率( Survival rate, SR) =(試驗(yàn)結(jié)束時蝦尾數(shù)/試驗(yàn)開始時投放的蝦尾數(shù))× 100%;

餌料系數(shù)( Feed conversion rate, FCR) =飼料攝入量/(終末體質(zhì)量－初始體質(zhì)量);

試驗(yàn)期間, 每 15d取樣一次, 每池隨機(jī)取 30尾蝦, 測其體長和體質(zhì)量。后用 5mL無菌注射器自第二腹節(jié)處插入采血, 將混合血樣放入冰盒中, 4℃保存過夜。血樣于第2天處理, 在4℃條件下以6000r /min離心10 min, 取上清液, 放入超低溫冰箱–80℃中保存待測。采樣當(dāng)天將此30尾蝦進(jìn)行肝胰腺合并采集,分析時, 將肝胰腺樣品稱量后, 按照9倍體積加入提前在0℃冰箱中預(yù)冷的0.1 mol /L, pH 6.4的磷酸緩沖液稀釋, 在冰浴中用勻漿器勻漿, 將勻漿液在0℃、2500r /min離心10 min 后, –80℃冰箱冷藏待用。

1.4 血清免疫及肝胰腺消化指標(biāo)測定

SOD測定采用南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒進(jìn)行; 溶菌活性測定將二次活化的溶壁微球菌活化培養(yǎng)48 h, 后收集菌體, 按Hultmark等[8]的方法, 用磷酸鉀鹽緩沖液(pH=6.4, 0.1mol/L)稀釋至A570nm=0.3, 配成底物懸液供測試用; 抑菌活性以大腸桿菌為底物, 將二次活化的本實(shí)驗(yàn)室分離的大腸桿菌活化培養(yǎng) 48 h, 后收集菌體, 按 Hultmark等[8]及 Boman等[9]的方法, 用磷酸鉀鹽緩沖液(pH=6.4,0.1mol/L)稀釋至A570nm= 0.3, 配成底物懸液供測試用; 蛋白酶活力以酪蛋白為底物, 取1 mL肝胰腺勻漿液與等體積的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4, 0.05 mol/L)混合, 加入20 g/L的酪蛋白底物溶液2 mL, 于37℃下消化反應(yīng) 30 min, 參考劉玉梅等[10]的方法測定;肝胰腺和血清中的總蛋白含量測定采用南京建成生物工程研究所考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用 SPSS 19.0分析軟件 One-way ANOVA模型來分析, 多重比較采用LSD法, 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)變化

養(yǎng)殖過程中的pH、NO2-N及NH4-N變化如表2所示, 生物飼料組與普通飼料組的環(huán)境理化因子無顯著性差異(P>0.05), pH維持在 7.5~7.9, NO2-N及NH4-N維持在較低水平。研究表明, 氨氮和亞硝酸氮的安全質(zhì)量濃度為0.500 mg/L以下[11]。

表2 蝦池中水化因子變化情況Tab.2 Variation of quality of water in the shrimp ponds

2.2 生物飼料對凡納濱對蝦生長性能的影響

由表3可知, 生物飼料組平均產(chǎn)量為1242.5 kg/ha,高于普通飼料組平均產(chǎn)量1180.5 kg/ha。生物飼料組成活率達(dá)91.5%, 高于普通飼料組的86.2%; 生物飼料餌料系數(shù)為0.96, 低于普通料的1.01。

表3 對蝦產(chǎn)量情況Tab.3 The shrimp production in farm

2.3 生物飼料對凡納濱對蝦免疫及消化性能的影響

如圖1所示, 超氧化物歧化酶(SOD)活性為1.195~2.150 U/mg, 喂養(yǎng)15 d時, 普通飼料SOD活性較高, 隨著喂養(yǎng)時間的延長, 生物飼料組對蝦的SOD活性開始上升, 至45 d生物飼料組顯著高于普通飼料組(P<0.05); 血清總蛋白含量為178~320 mg/mL,喂養(yǎng) 15 d時, 普通飼料含量較高, 隨著喂養(yǎng)時間延長, 生物飼料組對蝦血清總蛋白含量開始上升, 至45 d生物飼料組顯著高于普通飼料組(P<0.05); 溶菌活性為31~85 mU/mg, 投喂生物飼料15 d無顯著提高(P>0.05), 15 d后溶菌活力顯著上升, 持續(xù)顯著高于普通飼料組, 較普通飼料組有顯著性提高(P<0.05),普通飼料組溶菌活性無顯著波動; 抑菌活力變化范圍為9~38 mU/mg, 生物飼料未顯著提高對蝦抑菌活力, 與普通飼料組相比無顯著性差異(P>0.05)。

養(yǎng)殖現(xiàn)場觀察, 生物飼料組對蝦腸道粗長、均勻且清晰無炎癥, 蝦糞較松軟, 說明生物飼料有助于對蝦消化和吸收率的提高。由圖1可知, 生物飼料對凡納濱對蝦肝胰臟中的蛋白酶、總蛋白含量均有顯著影響(P<0.05)。總蛋白酶活性以生物料30 d時最高,前30 d生物飼料組均顯著高于普通飼料組。

圖1 生物飼料組與普通飼料組對蝦血清免疫功能及肝胰腺消化功能指標(biāo)的比較Fig.1 Hemolymph immune and hepatopancreas digestibility performance analysis of treatment-diet and control-diet

3 討論

3.1 生物飼料對凡納濱對蝦對蝦成活率的影響

由于養(yǎng)殖環(huán)境因子不穩(wěn)定、高溫、暴雨等頻發(fā),環(huán)境脅迫因子(如水體 pH、溫度、鹽度等)急劇變化誘導(dǎo)的生理效應(yīng)造成生物體內(nèi)有氧代謝異常[12-14],即活性氧自由基大量積累而引起機(jī)體的氧化損傷,抑制對蝦免疫系統(tǒng)功能, 降低對蝦的抗感染能力[15]。本試驗(yàn)生物飼料組對蝦成活率達(dá) 91.5%, 高于普通料組的 68.2%(表3), 可能是由于生物飼料中酶解蛋白的作用。酶解蛋白含有較高的抗氧化作用的生物活性小肽, 暴露大量酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、半胱氨酸及組氨酸, 使小肽具有極高的抗氧化活性, 緩解由環(huán)境脅迫因子引起機(jī)體的氧化損傷,從而使生物體抗病抗感染[16]。本試驗(yàn)針對飼料氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)生物飼料中含有較高的酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、半胱氨酸及組氨酸等(表1), 因此生物飼料可能通過抗氧化損傷從而提高對蝦成活率。

3.2 生物飼料對凡納濱對蝦免疫功能影響

甲殼動物非特異性免疫依靠血淋巴中的血細(xì)胞及多種活性因子組成一些非特異性酶或因子來進(jìn)行吞噬作用、血液凝集、結(jié)節(jié)形成及外排, 水解酶作用、酚氧化酶原激活系統(tǒng), 從而提高機(jī)體抗病能力[17-18]。本研究中生物飼料中的成分均可有效提高對蝦免疫性能, 酶解蛋白可增強(qiáng)溶菌酶活力、增加血清補(bǔ)體及LgM 濃度[4-5]; 破壁酵母其蛋白含量較高, 含有豐富的堿基、核酸、β-葡聚糖、維生素、木聚糖、寡甘露聚糖等, 往往作為生物活性物質(zhì)具有免疫增強(qiáng)的作用[19]; 此外發(fā)酵豆粕含有較多益生菌, 益生菌對腸道黏膜細(xì)胞有保護(hù)作用[20], 促進(jìn)腸道對外在細(xì)菌及物質(zhì)的保護(hù)屏障[20-21]。

SOD是一種重要的抗氧化酶, 對于增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個機(jī)體的免疫功能有重要作用, 因此SOD常作為機(jī)體免疫指標(biāo)來評判機(jī)體免疫力[22]。當(dāng)SOD活性降低時, 生物體內(nèi)會出現(xiàn)自由基過多的現(xiàn)象, 擾亂和破壞體內(nèi)一些重要的生化過程, 導(dǎo)致代謝混亂, 正常生理功能失調(diào), 體內(nèi)免疫水平下降,因此導(dǎo)致對蝦發(fā)病[23]。本試驗(yàn)投喂生物飼料30d后,SOD活性顯著上升, 并顯著高于普通飼料組。這說明生物飼料可以增強(qiáng)凡納濱對蝦的免疫力及抗病能力。

溶菌活性是機(jī)體免疫系統(tǒng)的綜合體現(xiàn), 反映了機(jī)體對病原微生物侵染的防御能力, 尤其是在高密度集約化養(yǎng)殖中, 對于增強(qiáng)對蝦抵抗疾病的能力發(fā)揮著重要作用[24]。本試驗(yàn)中對蝦投喂生物飼料15 d后溶菌活力顯著上升, 持續(xù)顯著高于普通飼料組(P<0.05)。有研究針對酵母提取物投喂凡納濱對蝦對蝦后, 發(fā)現(xiàn)對蝦溶菌活力顯著上升[25]。

血清抑菌活性在水產(chǎn)動物清除致病菌及毒素具有重要作用。研究表明對蝦免疫防御中抗菌肽發(fā)揮重要作用, 有學(xué)者從養(yǎng)殖凡納濱對蝦的血細(xì)胞和血漿中分離出幾種抗菌活性因子, 這些抗菌肽具有廣譜抗菌活性, 在血淋巴內(nèi)合成后以成熟肽的形式存在, 受到刺激后才釋放[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對抑菌活性的測定并無發(fā)現(xiàn)各時刻生物料組與普通料組有顯著性差異, 但夏季是弧菌病高發(fā)季節(jié), 水體中弧菌濃度較高。試驗(yàn)組對蝦具有較高的存活率, 達(dá)91.5%, 高于普通料組的 68.2%(表3), 說明生物飼料組對蝦具有較高的抗菌能力, 可能促進(jìn)抗菌物質(zhì)如抗菌肽的生成, 血淋巴中抗菌肽含量增加, 而在有細(xì)菌刺激的條件下, 抗菌肽大量釋放, 降解菌體的細(xì)胞壁, 從而提高了抗菌能力。

3.3 生物飼料對凡納濱對蝦消化功能及生長的影響

很多研究表明酶解蛋白、發(fā)酵豆粕及單細(xì)胞酵母蛋白均具有生長促進(jìn)作用[6,27-28]。酶解蛋白能夠?qū)⒌蛢r值的魚類加工副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為具有極高含量必需氨基酸的促生長及免疫促進(jìn)的生物功能物質(zhì)[16]; 發(fā)酵植物蛋白中益生菌菌數(shù)較高, 有利于保護(hù)對蝦腸道粘膜細(xì)胞, 有利于促進(jìn)生物飼料組對蝦的消化吸收從而促進(jìn)生長; 此外生物飼料中的破壁酵母, 其細(xì)胞壁的某些成分如β-葡聚糖、寡甘露聚糖等, 據(jù)報道有調(diào)節(jié)腸道微生物群系從而有利于水產(chǎn)動物消化吸收的作用[26]。本試驗(yàn)中, 生物料組平均產(chǎn)量為1242.5 kg/ha, 高于普通料組平均產(chǎn)量 1180.5 kg/ha,具有更優(yōu)的生長性能。

對蝦消化酶活性的提高與食物消化率、生長的增長有極大相關(guān)性[29], 本試驗(yàn)生物飼料的組成中含有發(fā)酵豆粕, 可以消除普通豆粕中蛋白酶抑制因子的影響, 因而對蝦總蛋白酶活性并未受到抑制, 前30 d均顯著高于普通飼料組, 說明生物飼料對提高對蝦消化功能、促進(jìn)生長有一定作用, 但有關(guān)生物飼料的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

[1] Smith L L, Lee P G, Lawrence A L, et al.Growth and digestibility by three sizes of Penaeus vannamei Boone:effects of dietary protein level and protein source[J].Aquaculture, 1985, 46(2): 85-96.

[2] Akiyama D M, Dominy W G, Association A S.Penaeid shrimp nutrition for the commercial feed industry:American Soybean Association St.Louis, MO, 1989.

[3] Hermannsdottir R, Johannsdottir J, Smaradottir H, et al.Analysis of effects induced by a pollock protein hydrolysate on early development, innate immunity and the bacterial community structure of first feeding of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossusL.)larvae[J].Fish & Shellfish Immunology, 2009;27(5):595-602.

[4] Liang M, Wang J, Chang Q, et al.Effects of different levels of fish protein hydrolysate in the diet on the nonspecific immunity of Japanese sea bass,Lateolabraxjaponicus(Cuvieret Valenciennes,1828)[J].Aquaculture Research, 2006, 37(1): 102-106.

[5] Tang H g, Wu T x, Zhao Z y, et al.Effects of fish protein hydrolysate on growth performance and humoral immune response in large yellow croaker(Pseudosciaena croceaR.)[J].Journal of Zhejiang University Science B, 2008, 9(9): 684-690.

[6] Millamena O M, Teruel M, Kanazawa A, et al.Quantitative dietary requirements of postlarval tiger shrimp, Penaeus monodon, for histidine, isoleucine,leucine, phenylalanine and tryptophan[J].Aquaculture,1999, 179(1): 169-179.

[7] Oliva-Teles A, Gon?alves P.Partial replacement of fishmeal by brewers yeast (Saccaromyces cerevisae) in diets for sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles[J].Aquaculture, 2001, 202(3): 269-278.

[8] Hultmaek D, Steiner H, Rasmuson T, et al.Insect immunity.Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae ofHyalophora cecropia[J].European Journal of Biochemistry, 1980, 106(1): 7-16.

[9] Boman H G, Nilsson-Faye I, Paul K, et al.Insect immunity I.Characteristics of an inducible cell-free antibacterial reaction in hemolymph ofSamia cynthiapupae[J].Infection and Immunity, 1974, 10(1): 136-145.

[10] 劉玉梅, 朱謹(jǐn)釗.對蝦消化酶的研究[J].海洋科學(xué),1984, 5: 46-50.

[11] 姜令緒, 潘魯青, 肖國強(qiáng).氨氮對凡納對蝦免疫指標(biāo)的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué), 2005, 11(6): 537-541.

[12] Li C C, Chen J C.The immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility toVibrio alginolyticusunder low and high pH stress[J].Fish & Shellfish Immunology, 2008, 25(6): 701-709.

[13] Tseng I T, Chen J C.The immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility toVibrio alginolyticusunder nitrite stress[J].Fish &Shellfish Immunology, 2004, 17(4): 325-333.

[14] Bachère E.Shrimp immunity and disease control[J].Aquaculture, 2000, 191(1): 3-11.

[15] 王蕓, 李健, 李吉濤, 等.pH 脅迫對中國明對蝦抗氧化系統(tǒng)酶活力及基因表達(dá)的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué), 2011, 18(3): 556-564.

[16] Sarmadi B H, Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins: a review[J].Peptides, 2010, 31(10):1949-1956.

[17] 徐海圣, 徐步進(jìn).甲殼動物細(xì)胞及體液免疫機(jī)理的研究進(jìn)展[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 2001, 16(1): 49-56.

[18] Jiravanichpaisal P, Lee B L, S?derh?ll K.Cell-mediated immunity in arthropods: hematopoiesis, coagulation,melanization and opsonization[J].Immunobiology,2006, 211(4): 213-236.

[19] Omar S S, Merrifield D L, Kühlwein H, et al.Biofuel derived yeast protein concentrate (YPC) as a novel feed ingredient in carp diets[J].Aquaculture, 2012, 330:54-62.

[20] Standen B, Rawling M, Davies S, et al.Probiotic Pediococcus acidilactici modulates both localised intestinal-and peripheral-immunity in tilapia (Oreochromis niloticus)[J].Fish & shellfish immunology, 2013, 35(4):1097-1104.

[21] Skalli A, Castillo M, Andree K B, et al.The LPS derived from the cell walls of the Gram-negative bacteria Pantoea agglomerans stimulates growth and immune status of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)juveniles[J].Aquaculture, 2013, 416: 272-279.

[22] 李光友.中國對蝦疾病與免疫機(jī)制[J].海洋科學(xué),1995, 4(1): 3.

[23] 丁美麗, 林林.有機(jī)污染對中國對蝦體內(nèi)外環(huán)境影響的研究[J].海洋與湖沼, 1997, 28(1): 7-12.

[24] Chen S-C, Yoshida T, Adams A, et al.Immune response of rainbow trout to extracellular products of Mycobacterium spp.[J].Journal of Aquatic Animal Health, 1996, 8(3): 216-222.

[25] Deng D, Mei C, Mai K, et al.Effects of a yeast based additive on growth and immune responses of white shrimp,Litopenaeus vannamei(Boone, 1931), and aquaculture environment[J].Aquaculture Research,2013, 44(9): 1348-1357.

[26] Destoumieux D, Bulet P, Loew D, et al.Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimpPenaeus vannamei(Decapoda)[J].Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(45): 28398-28406.

[27] Refstie S, Olli J J, Standal H.Feed intake, growth, and protein utilisation by post-smolt Atlantic salmon(Salmo salar) in response to graded levels of fish protein hydrolysate in the diet[J].Aquaculture, 2004,239(1): 331-349.

[28] Zheng K, Liang M, Yao H, et al.Effect of dietary fish protein hydrolysate on growth, feed utilization and IGF-I levels of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)[J].Aquaculture Nutrition, 2012, 18(3): 297-303.

[29] Nya E J, Austin B.Dietary modulation of digestive enzymes by the administration of feed additives to rainbow trout,Oncorhynchus mykissWalbaum[J].Aquaculture Nutrition, 2011, 17(2): e459-e466.