尹金磊，關(guān)素珍

(河南省南陽市中心醫(yī)院中藥科，河南南陽 473000)

益母草飲片中鹽酸水蘇堿、益母草堿含量測定的應(yīng)用研究*

尹金磊，關(guān)素珍

(河南省南陽市中心醫(yī)院中藥科，河南南陽 473000)

目的:總結(jié)分析益母草飲片中鹽酸水蘇堿、益母草堿含量測定的不同方法，為應(yīng)用適宜、準確、可靠的方法測定益母草飲片中有效成分含量提供依據(jù)。方法:分析細管電泳法、紫外分光光度法、薄層色譜法和高效液相色譜法(HPLC)在含量測定上的優(yōu)劣，針對鹽酸水蘇堿、益母草堿的的分子和含量特點，選擇HPLC法測定益母草中鹽酸水蘇堿、益母草堿的含量，選取適宜的色譜條件和檢測器進行檢測研究，測定益母草飲片中二者的含量。結(jié)果:經(jīng)多方面比對，HPLC法是測定鹽酸水蘇堿、益母草堿簡便準確的方法，進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，鹽酸水蘇堿線性方程為Y=81065X+433.5(r=0.9997)，平均加樣回收率98.83%，RSD為0.95%，益母草堿線性方程為Y=5202.64X-221.14(r=0.9998)，平均加樣回收率98.62%，RSD1.41%。結(jié)論:本研究所選用的HPLC法在測定益母草飲片中鹽酸水蘇堿、益母草堿的含量時專屬性強、相關(guān)性好、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確，是測定益母草飲片有效成分含量的可靠方法。

鹽酸水蘇堿;益母草堿;含量測定

益母草為唇形科益母草屬植物的新鮮或干燥的地上部分，全草入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性微寒、味辛、微苦，入心包、肝經(jīng)，是活血調(diào)瘀、利尿消腫之要藥，也是中醫(yī)婦科良藥，主要化學(xué)成分為生物堿類、二萜類、苯丙醇苷、揮發(fā)油、環(huán)形多肽等［1］，生物堿類為益母草的主要有效成分，鹽酸水蘇堿和益母草堿在其中含量較高，是評價其質(zhì)量的主要指標［2］。目前鹽酸水蘇堿的含量測定方法有薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細管電泳法［3］、比色法、紫外分光光度法、離子交換法等，薄層掃描法和高效液相色譜法(HPLC)較為多用［4］。益母草堿的含量測定方法也多采用HPLC法［5］。本研究采用HPLC法，鹽酸水蘇堿使用蒸發(fā)光散射檢測器，益母草堿使用紫外檢測器。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，PL-ELS2100蒸發(fā)光散射檢測器，島津 SPD-10Avp紫外檢測器; ChemStation色譜工作站;色譜柱:Pgrandsil HILIC柱(250×4.6 mm 5 μm)，A gilent EdipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);METTLER AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

益母草飲片購自藥材公司，經(jīng)鑒定為唇形科植物益母草的干燥全草。鹽酸水蘇堿對照品(批號110712-200508，含量測定用中國食品藥品檢定研究院)、鹽酸益母草堿對照品(安徽新星藥物開發(fā)有限公司，純度＞98%)。甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。其他試劑如磷酸二氫鉀(分析純)、三乙胺(分析純)、磷酸(分析純)、醋酸乙酯(分析純)、95%乙醇(分析純)、中性氧化鋁(100～200目)，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 水蘇堿含量測定色譜條件 色譜柱: Pgrandsil HILIC柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20);蒸發(fā)光散射檢測器(氮氣流量2.5 L·min－1，漂移管溫度90℃)，柱溫: 30℃;1.0 mL·min－1流速。進樣量對照品溶液10 μL，供試品溶液10～20 μL，計算用外標兩點法對數(shù)方程。

2.1.2 益母草堿含量測定色譜條件 色譜柱: A gilent EdipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.01%，磷酸水溶液洗脫(24∶76);檢測波長277 nm，柱溫25℃，流速1.0 mL·min－1，進樣量10 μL。

2.2 各溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量鹽酸水蘇堿和益母草堿對照品，分別加70%乙醇制成每毫升含鹽酸水蘇堿0.502 mg及每毫升含益母草堿35.12 μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定樣品細粉1.0 g放于錐形瓶，精密加50 ml乙醇，稱定質(zhì)量，水浴回流2 h冷至室溫，再稱定質(zhì)量，減失的質(zhì)量以乙醇補足、濾過，取續(xù)濾液供試品溶液即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按供試品溶液制備的方法，制備缺益母草空白樣品。

2.3 線性關(guān)系考察

2.3.1 鹽酸水蘇堿 精密量取鹽酸水蘇堿對照品51.48 mg，置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成每1 ml含鹽酸水蘇堿1 mg(C= 1.0296 mg/mL)。對照品溶液制定:分別精密吸取此溶液1、3、5、7、9 ml放入10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度;分別精密吸取20 μL對照品溶液，按上述色譜條件進行分析并測定峰面積。表1顯示，以進樣量(μg)對峰面積A(μV·s)進行線形回歸，得回歸方程:Y=81065X+433.5，r=0.9997，表明鹽酸水蘇堿在2.0592～18.5328 μg之間呈良好的線性。

表1 鹽酸水蘇堿線性回歸方程

2.3.2 益母草堿 精密量取鹽酸水蘇堿對照品125.13 mg置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成每毫升含鹽酸水蘇堿2.5 mg(C= 2.5026 mg/mL)。對照品溶液制定:分別精密吸取此溶液1、2、3、4、5 ml放入10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度;分別精密吸取10 μL對照品溶液，按上述色譜條件進行分析。表2顯示，以進樣量(μg)對峰面積A(μV·s)進行線性回歸，得出回歸方程:Y= 5202.64X-221.14，r=0.9998，表明鹽酸水蘇堿在2.5206～12.513 μg之間呈良好的線性。

表2 益母草堿線性回歸方程

2.4 精密度考察

精密吸取鹽酸水蘇堿、益母草堿對照品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次，每次20 μL，測定峰面積。5次試驗測定的相對標準偏差低于2%，表明儀器具有良好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品溶液，依上述色譜條件分別于0、2、4、6、8 h各進樣20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液中鹽酸水蘇堿、益母草堿在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實驗

同一批樣品取6份，按照擬定測定方法，測定出鹽酸水蘇堿平均含量為1.21%，RSD為1.03%(n =6)，益母草堿平均含量為0.0486%，RSD為1.8% (n=6)，結(jié)果表明該法重現(xiàn)性良好。

2.7 回收率實驗

采用加樣回收法，精密稱取已測知含量的益母草細粉約0.6 g5份，加入鹽酸水蘇堿對照品約2 mg/mL，另取5份加入益母草堿對照品0.5 mg/mL，按“2.2.2”項下制備供試溶液，按上述色譜條件測定。計算鹽酸水蘇堿、益母草堿回收率98.83%、98.62%，RSD為0.95%、1.41%。

2.8 樣品含量測定

表3顯示，分別取3個批號的益母草藥材樣品，按供試品的制備方法進行處理，精密吸取對照品溶液和樣品溶液20 μL，分別進樣測定峰面積，計算含量。

表3 樣品測定結(jié)果

3 討論

經(jīng)現(xiàn)代藥理研究顯示，鹽酸水蘇堿和益母草堿是益母草飲片中的有效活性成分，對益母草飲片的質(zhì)量檢測多以鹽酸水蘇堿作為對照。益母草飲片中益母草堿含量略低于鹽酸水蘇堿，但也具有很強的生物活性，因此益母草堿的測定具有重要價值。

測定鹽酸水蘇堿含量的方法較多，有雷氏鹽比色法、紫外分光光度法、薄層掃描法(TLC)、高效液相色譜紫外檢測器(HPLC-UV)法、高效液相色譜示差折光檢測器法(HPLC-RID)或高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測器法(HPLC-ELSD)等。TLC法有許多優(yōu)點，其操作方便、設(shè)備簡單、顯色容易等，然而TLC法定量準確性差、影響因素多，因而更多的研究采用HPLC法測定鹽酸水蘇堿的含量，選用的檢測器主要是UV、RID和ELSD。UV是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光原理設(shè)計的檢測器，適用于具有紫外或可見光吸收基團的有機分子，具有紫外或可見光吸收能力的物質(zhì)檢測。一般當(dāng)物質(zhì)在200～400 nm有紫外吸收時，考慮用UV。UV靈敏度高、線性范圍寬、噪音低、有較好的選擇性，且穩(wěn)定性強，對于環(huán)境溫度、流動相組成和流速的變化敏感度低，可用于制備色譜，但對紫外吸收差的化合物靈敏很低。由于鹽酸水蘇堿的紫外吸收為末端吸收，且其極性較大［6］，因此UV檢測基線不穩(wěn)定影響檢測結(jié)果［7］。RID是高度穩(wěn)定和靈敏的液相色譜和凝膠滲透色譜檢測器，RID對所有物質(zhì)都有響應(yīng)，是一種通用型檢測器，具有廣泛的適用范圍，對沒有紫外吸收的物質(zhì)都能夠檢測，且樣品處理只需超聲處理，不要再過離子交換柱凈化。但與UV比較，RID的靈敏度較低，一般不用于痕量分析。由于鹽酸水蘇堿的結(jié)構(gòu)中有旋光性的特點，也可考慮采用高 HPLC-RID法測定其含量［8］，只是該方法國內(nèi)應(yīng)用較少，條件并不成熟，且專屬性不強，靈敏度低，與梯度脫洗不相容，還需進一步研究。ELSD是通用型檢測器，紫外區(qū)無吸收的有機物質(zhì)可以應(yīng)用其進行檢測，ELSD不同于熒光和紫外檢測器，它很好地解決了傳統(tǒng)HPLC檢測方法中常見的問題。揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被ELSD檢測，它的響應(yīng)不受樣品光學(xué)特性和官能團的影響。ELSD還用于測定樣品的純度或者檢測未知物，因為其響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比。鹽酸水蘇堿基本無紫外吸收，故采用具有更高靈敏度的ELSD進行檢測。色譜柱選用Pgrandsil HILIC柱，是因為鹽酸水蘇堿具有很大的極性，應(yīng)選擇親水作用色譜模式進行分離，因為親水作用色譜可為強極性的化合物提供較合適的保留，而傳統(tǒng)反相色譜不能很好地保留和分離，通常在死時間流出，所以不建議選擇［9］。

益母草飲片為臨床常用中藥品種，建立統(tǒng)一的質(zhì)量標準，是保證患者用藥安全有效的前提，因此對于其中有效成分的檢測方法應(yīng)引起足夠重視。按照《中國藥典》［9］2010版要求，益母草飲片中鹽酸水蘇堿的含量不得少于0.40%［10］。故應(yīng)系統(tǒng)總結(jié)科學(xué)分析，選取最優(yōu)化準確的測定方法。本研究所選用的HPLC法在測定益母草飲片中鹽酸水蘇堿、益母草堿的含量時，專屬性強、相關(guān)性好、重現(xiàn)性好、準確度高，是測定益母草飲片成分含量的有效方法，為益母草飲片中鹽酸水蘇堿、益母草堿含量測定的應(yīng)用研究提供了可靠的依據(jù)。

［1］趙彩霞，蔡長春，張增巧，等．益母草的藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展［J］．臨床誤診誤治，2011，24(2):82-84．

［2］蔣歆，丁永輝，魏學(xué)冰，等．HPLC-ELSD測定八珍益母丸中水蘇堿的含量［J］．中成藥，2011，33(3):542-544．

［3］羅毅，文為，周本宏，等．高效毛細管電泳法測定益母草總堿中鹽酸水蘇堿的含量［J］．山西醫(yī)藥雜志，2011，40(10): 1036-1037．

［4］楊瓊．HPLC法測定益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量［J］．中國中醫(yī)藥咨訊，2011，3(1):17-18．

［5］郝巨祥，鞠延玲，劉海洋，等．HPLC測定抗宮炎軟膠囊中益母草堿的色譜條件的研究［J］．中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(5):73-75．

［6］陳婷，莫灼康．中藥材益母草中水蘇堿含量鑒定分析［J］．中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6(13):133-134．

［7］王曉燕，王舒．HPLC-ELSD法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量［J］．實用醫(yī)藥雜志，2012，29(6):523-524．

［8］黃強增．HPLC-RID法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量［J］．海峽藥學(xué)，2012，24(11):63-65．

［9］張文婷，黃偉，王偉勝，等．不同采收期童子益母草中生物堿含量比較［J］．醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(2):218-220．

［10］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:272-273．

R285．5

A

1006-3250(2015)04-0459-02

2015-01-09

河南省衛(wèi)生廳重點督辦項目(HW-2010BNO．033)

尹金磊(1973-)，女，副主任藥師，從事中藥學(xué)和臨床中藥學(xué)的研究。