孔沈燕，楊小紅

(1．成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，成都 6100751;2．河南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，鄭州 450046)

四君子湯對脾虛證胃癌MGC803細胞周期凋亡及Caspase-3表達的影響*

孔沈燕1，2，楊小紅2

(1．成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，成都 6100751;2．河南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，鄭州 450046)

目的:探討四君子湯對脾虛證胃癌MGC803細胞周期凋亡及Caspase-3表達。方法:采用倒置顯微鏡觀察人胃癌MGC803細胞形態(tài)學變化，透射電鏡觀察染色情況，采用流式細胞術檢測細胞周期及凋亡，采用免疫組化法檢測Caspase-3蛋白表達情況。結果:倒置顯微鏡下5umol/L四君子湯組作用48 h后胃癌細胞數(shù)目減少，細胞分裂不明顯，體積明顯縮小，可發(fā)現(xiàn)核固縮現(xiàn)象以及圓形體積變小的凋亡小體形成;透射電鏡下5umol/L四君子湯處理后細胞膜微絨毛減少，胞質(zhì)有所濃縮且細胞體積變小，核染色聚集與核膜，電子密度高，可見明顯的凋亡小體;流式細胞儀檢測結果顯示，四君子湯可誘導MGC803發(fā)生凋亡，細胞周期檢測顯示G0/G1期比值明顯增加，而在S其與G2/M期則降低，故在G0/G1期發(fā)生阻滯;5umol/L四君子湯組Caspase-3表達顯著高于0.1%DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義。結論:四君子湯對脾虛證胃癌MGC803具有明顯促凋亡作用，細胞周期阻滯在G0/G1期，且通過增加Caspase-3表達而促進其凋亡。

四君子湯;脾虛證;MGC803;細胞周期凋亡;Caspase-3表達

胃癌是常見的一種惡性腫瘤，約占惡性腫瘤死亡人數(shù)的 1/4［1-2］，腫瘤治療中補益法是其常用法［3］。大多數(shù)學者研究報道顯示，補氣藥可抑制腫瘤的生長，從而使患者生存期延長，生活質(zhì)量得以提高。而有少數(shù)學者認為，補益藥可促進腫瘤的生長，不宜多用［4-6］。近年來研究報道顯示，體外培養(yǎng)四君子湯對胃癌細胞具有一定的抑制作用［7］。本研究主要探討四君子湯對脾虛證胃癌MGC803細胞周期分布、凋亡以及Caspase-3蛋白表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 主要試劑 人胃癌MGC803細胞(購自于四川大學華西藥學院)，流式細胞儀(由美國BD公司生產(chǎn))，Caspase-3蛋白單克隆抗體(北京博奧森公司)，Cycle TESTTMPLUS試劑盒(購買美國Bection Dikinson公司產(chǎn)品)，四君子湯由本院中藥房提供。

1.1.2 主要儀器 北京醫(yī)用離心機廠離心機(型號 LDZ5-2)，日本 JEOL公司透射電鏡，日本OLYMPUS倒置顯微鏡，美國BD公司流式細胞儀(FACS-Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 MGC803體外細胞培養(yǎng) 在75ml的培養(yǎng)瓶中接種MGC803細胞，加入RPMI-1640培養(yǎng)液15ml進行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:37℃，5%CO2)，細胞呈貼壁上皮樣生長，4 h后加入濃度為5 umol/L四君子湯，并設對照組(0.1%DMSO組)，加藥48 h后在倒置顯微鏡下對其細胞形態(tài)學進行觀察。

1.2.2 透射電鏡觀察 收集細胞采用戊二醛(百分數(shù)為2.5%)固定120 min，使用PBS沖洗3次，每次沖洗時間為10 min，再采用四氧化鋨(百分數(shù)為1%)固定30～40 min，使用PBS沖洗3次，每次沖洗時間為10 min，采用梯度乙醇進行脫水，同時采用環(huán)氧樹丙酮混合液浸泡1 d。其次進行包埋、修塊以及定位，給予硝酸鉛、醋酸鈾雙重染色，用透射電鏡進行觀察。

1.2.3 流式細胞儀檢測 收集培養(yǎng)48 h四君子湯混合培養(yǎng)液處理的細胞，加藥分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后取出，離心(1500 r/min)收集細胞，PBS洗滌，再離心2次(1500 r/min)，將其制成細胞懸液，染色采用Cycle TESTTMPLUS DNA Kit法，上機檢測。增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) ×100%。

1.2.4 免疫細胞化學染色檢測Caspase-3蛋白表達 標本制作應用細胞涂片法，染色陽性部位在胞漿的片子，如染色陽性部位在細胞核，則實驗過程中應將其胞核染成棕褐色。0.1%DMSO組加入生理鹽水，四君子湯總濃度為5 umol/L加入實驗組內(nèi)，給藥后作用24 h。

染色按照試劑盒說明書完成。染色結果判定，陽性的細胞內(nèi)能夠發(fā)現(xiàn)清晰棕色顆粒作為實驗結果，Caspase-3主要在胞質(zhì)中表達。若細胞不著色或著色較淺則表明為陰性結果。陽性表達率(%)=陽性細胞總數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)觀察

圖1、2顯示，倒置顯微鏡下觀察0.1%DMSO組胃癌MGC803細胞貼壁緊，細胞形態(tài)為多邊形，細胞核分裂相對較多，且整個細胞中胞核所占比例最大。而5 umol/L四君子湯組作用48 h后胃癌細胞數(shù)目減少，細胞分裂不明顯，體積明顯縮小，可發(fā)現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，同時能夠發(fā)現(xiàn)圓形體積變小的凋亡小體形成。

2.2 電鏡下細胞的形態(tài)改變

圖3顯示，0.1%DMSO組MGC803細胞表面呈現(xiàn)豐富的微絨毛，同時可觀察到其胞質(zhì)豐富以及豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體，核膜清楚，核仁大;5umol/L四君子湯處理后細胞膜微絨毛減少，胞質(zhì)有所濃縮且細胞體積變小，核染色聚集于核膜，電子密度高，可見明顯的凋亡小體。

圖10 .1%DMSO胃癌MGC-803細胞(×200)

圖2 5 umol/L四君子湯胃癌MGC-803細胞(×200)

2.3 流式細胞術檢測胃癌MGC803細胞周期與凋亡的影響

表 1、2顯示，G0/G1期 0.1%DMSO組與5umol/L四君子湯組均出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，其分裂周期由G1期進入S期，且存在時間依賴性。同時S期細胞數(shù)量隨時間的增加而呈現(xiàn)明顯減少趨勢，而在G0/G1期細胞數(shù)量則呈現(xiàn)顯著增加趨勢;G0/G1期細胞數(shù)量根據(jù)時間的不同而明顯不同，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);5 umol/L四君子湯作用72 h后其凋亡率出現(xiàn)下降，而在G0/G1期仍表現(xiàn)出顯著的阻滯現(xiàn)象;MGC803增殖活性隨四君子湯的處理時間增加而降低。

圖3 四君子湯誘導MGC830細胞凋亡的形態(tài)觀察(×5000)注:左:0.1%DMSO組;右:5 umol/L四君子湯組

2.4 Caspase-3蛋白表達水平的檢測

表3、圖4、5顯示，通過免疫組化研究表明，5umol/L四君子湯組Caspase-3表達顯著高于0.1% DMSO組，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);陽性細胞為胞漿胞核染成棕褐色，有圖可知5umol/L四君子湯組陽性細胞數(shù)目增多。

3 討論

腫瘤是細胞周期一類疾病，癌變過程中細胞周期調(diào)控因子是其主要攻擊目標，同時也為對抗腫瘤藥物研究的理想靶點［8-10］。胃癌化療過程中，胃癌的多耐藥性是其一大難題［11］。Caspase是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，在細胞凋亡過程中Caspase-3具有重要作用，Caspase-3在細胞中存在形式主要為酶原［12］。近年來研究報道顯示，Caspase-3表達的高低與胃癌分化程度可能存在一定的相關性，其表達在低分化胃癌中較低［13］。藥物經(jīng)Caspase-3途徑誘導腫瘤細胞凋亡，主要具有兩方面作用，包括促進Caspase-3蛋白的表達和促進Caspase-3的活化。

表1 四君子湯對胃癌MGC803細胞周期的影響(%，±s)

表1 四君子湯對胃癌MGC803細胞周期的影響(%，±s)

注:對0.1%DMSO組比較:*P＜0.05

時間(h)0.1%DMSO 組5umol/L 四君子湯組G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M 24 51.02±1.17 35.94±1.64 12.48±0.45 59.10±1.27* 26.58±1.82* 15.27±0.62*48 53.09±1.09 33.51±1.98 13.04±0.51 65.08±1.62* 24.26±2.01* 9.79±0.58*72 55.92±1.27 30.61±2.01 15.82±0.49 68.12±1.57* 22.43±1.96* 8.59±0.46*

表2 四君子湯對胃癌MGC803細胞凋亡的影響

表3 四君子湯對Caspase-3蛋白表達的影響

圖4 0.1%DMSO組Caspase-3蛋白表達24 h(×200)

圖5 5 umol/L四君子湯組Caspase-3蛋白表達24 h(×200)

本文研究主要針對脾虛證胃癌患者。四君子湯主治由脾胃氣虛、運化乏力所致的病癥。脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃氣虛，受納與健運乏力，則飲食減少;濕濁內(nèi)生，故大便溏薄;脾主肌肉，脾胃氣虛，四肢肌肉無所稟受，故四肢乏力;氣血生化不足，血不足不榮于面，而見面色萎白;脾為肺之母，脾胃一虛肺氣先絕，故見氣短、語聲低微、舌淡苔白、脈虛弱皆為氣虛之象。正如《醫(yī)方考》所說:“夫面色萎白，則望之而知其氣虛矣;言語輕微，則聞之而知其氣虛矣;四肢無力，則問之而知其氣虛矣;脈來虛弱，則切之而知其氣虛矣?！敝我搜a益脾胃之氣，以復其運化受納之功。方中人參為君，甘溫益氣，健脾益胃，可使人體免疫功能顯著提高，抑制腫瘤的生長［14］;臣以苦溫之白術健脾燥濕，加強益氣助運之力;佐以甘淡茯苓健脾滲濕，苓術相配則健脾祛濕之功益著，三藥合用可溫煦全身，激發(fā)機體生命活力;補氣從而增強體質(zhì)，因氣旺則血生，氣旺則血行［15］;以炙甘草益氣和中、調(diào)和諸藥，四藥配伍共奏益氣健脾之功。

本文研究結果表明，5 umol/L四君子湯作用72 h后其凋亡率出現(xiàn)下降，而在G 0/G1期仍表現(xiàn)出顯著的阻滯現(xiàn)象，MGC803增殖活性隨著四君子湯的處理時間增加而降低。由此可知，四君子湯可能引起細胞不可逆損傷，從而發(fā)展為凋亡。而Caspase家族成員在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，其中Caspase-3直接參與重要底物的剪切，從而使細胞結構的物質(zhì)解體得以維持。本文研究結果顯示，5umol/L四君子湯組Caspase-3表達顯著高于0.1% DMSO組(0umol/L)，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)一種劑量依賴性升高。綜上所述，四君子湯具有抑制MGC803腫瘤細胞增殖作用，使細胞周期阻滯于G 0/G1期且誘導其凋亡。

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Effects of Sijunzi Decoction on the cell cycle apoptosis and the expression of Caspase-3 in gastric cancer MGC803 of spleen deficiency syndrome

KONG Shen-yan1，2，YANG Xiao-hong2

(1．School of Basic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China; 2．School of Basic Medicine，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China)

Objective:To investigate Sijunzi decoction Caspase-3 expression and MGC803 gastric cell cycle and apoptosis in spleen deficiency．Methods:MGC803 inverted microscope morphological changes in human gastric cancer cells，transmission electron microscopy staining;using flow cytometry cell cycle and apoptosis;detection of Caspase-3 protein expression using immunohistochemistry．Results:The inverted microscope 5umol/L Sijunzi decoction group for 48h to reduce the number of gastric cancer cells，cell division is not obvious，the volume was significantly reduced，the phenomenon can be found karyopyknosis and smaller size of the circular formation of apoptotic bodies;TEM 5umol/L after treatment Sijunzi decoction membrane microvilli，cytoplasmic somewhat concentrated and smaller cell size，nuclear chromatin aggregation and nuclear membrane，high electron density，showed obvious apoptotic bodies;flow cytometry results Sijunzi decoction MGC803 can induce apoptosis，cell cycle analysis showed that the ratio of G0/G1 phase increased significantly，while the S with the G2/M phase was reduced，so arrest occurred in the G0/G1 phase;5umol/L Sijunzi decoction group Caspase-3 expression was significantly higher than 0.1%DMSO group，and the difference was significant．Conclusion:Sijunzi decoction gastric MGC803 for spleen deficiency has obvious effect on apoptosis and cell cycle arrest in G0/G1 phase and by increasing the expression of Caspase-3 induce apoptosis．

Sijunzi decoction;Spleen deficiency;MGC803;Cell cycle apoptosis;Caspase-3 expression

R285．5

B

1006-3250(2015)04-0412-04

2015-01-22

河南省自然科學基金資助項目(496060303)

孔沈燕(1977-)，女，河南蘭考人，講師，醫(yī)學碩士，從事中醫(yī)各家學說研究。