舒 琥 岳 磊 李 強 藍昭軍 谷平華 王杭軍 吳土金

(1.廣州大學生命科學學院 廣州 510006;2.韶關市水產(chǎn)研究所 韶關 512006)

光倒刺 鲃(Spinibarbus hollandi),隸屬鯉形目、鯉科、亞科、倒刺 鲃屬,主要分布于長江以南各水系(廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所等,1981),具有體形好、肉質佳、食性雜、適應性強、生長快等優(yōu)點。目前,由于江河污染的加劇和人類無限制的捕撈,致使自然資源逐漸減少,到了瀕危的邊緣,因此 光倒刺 鲃的人工繁殖愈加受到重視,繁育技術取得較大的發(fā)展(鄧維德等,2013)。線粒體DNA(mtDNA)是真核生物的核外遺傳物質,具有基因組結果簡單、編碼效率高、進化速率快、無組織特異性和母系遺傳等特性(董麗娜等,2011),特別是其中的COI基因具有進化速率適中等特性,可作為系統(tǒng)進化研究的良好標記(付景等,2006)。 本實驗對光倒刺 鲃雜交子一代及其親本的COI基因進行了測序分析,不僅為光倒刺 鲃雜交子代的mtDNA遺傳效應的研究提供理論基礎,同時對光倒刺 鲃新品種的選育具有指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

DNA提取采用上海生工的試劑盒,DNA放置在–80°C保存?zhèn)溆谩U增 COI全序列的引物序列為:COI-F: GGGGCTGATAGGAAGAGGAC,COI-R: TTC GATTCCTCCCTTCCTCG。反應總體積為25μL,其中ddH2O 7.5μL,Mix 12.5μL,模板 DNA 3μL,上下游引物各 1μL。反應程序為: 95°C預變性5min,94°C變性30s,53°C退火30s,68°C延伸2min,共30個循環(huán);最后68°C延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測。

對測序結果進行人工拼接與矯正,然后將校準過的序列與已發(fā)表的光倒刺線粒體全基因序列進行比對,驗證所測得片段就是所需要的目標序列。最后將該校準的序列以 FASTA格式文件保存。運用MegAlign進行序列間相似度的比對和差異性分析,而其中的堿基含量、變異位點、簡約信息位點及序列堿基間替換情況則運用MEGA5.0統(tǒng)計(Tamura et al,2007),同時采用 Kimura雙參數(shù)模型(Kimura,1981)計算遺傳距離,構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 COI基因的PCR結果

在6組共18 個光倒刺鲃個體中均擴增出約1800bp的片段如圖1。

圖1 光倒刺 鲃mtDNA COI基因片段擴增結果Fig.1 The PCR amplification products of mtDNA COI genes of S.hollandi

2.2 COI基因序列及其堿基組成

對 PCR擴增出來的片段進行序列測定,對比得到6 組光倒刺mtDNA COI 1551bp的堿基序列,由于其中有 6個堿基插入導致對比出來的序列長為1557bp(除去部分 tRNA-Tyr基因序列和部分的tRNA-Ser基因序列)。在 18 個光倒刺 鲃個體的 COI基因序列中,共檢測到 35個可變核苷酸位點,其中28個簡約信息位點,另外1522個為保守核苷酸位點。長江的2 個光倒刺 鲃母本和北江的3 個光倒刺 鲃母本共享一個單倍型(C-1),另一個長江的光倒刺 鲃母本單倍型為(CC-1),長江的3 個光倒刺 鲃父本和北江的3 個光倒刺父本共享一個單倍型(X-1),長江光倒刺母本與北江光倒刺 鲃父本雜交子一代 3個個體共享3個單倍型(Z-1,Z-4,Z-5),長江的光倒刺 鲃父本與北江光倒刺母本雜交子一代3個個體共享2個單倍型(Z-2,Z-3)。其中18 個光倒刺 鲃個體的COI基因序列中 T、C、A、G堿基的平均含量分別為 29.9%、25.4%、27.2%、17.5%。

2.3 COI基因核苷酸序列同源性分析

6組18 個光倒刺 鲃個體的 COI基因同源性在98.1%—99.9%之間。子一代單倍型(Z-1)與母本 2種單倍型(C-1,CC-1)的同源性分別為99.4%、99.8%,與父本單倍型(X-1)的同源性為 98.5%。子一代單倍型(Z-2)與母本單倍型(C-1)的同源性為 99.7%,與父本單倍型(X-1)的同源性為 98.2%。子一代單倍型(Z-3)與母本單倍型(C-1)的同源性為99.6%,與父本單倍型(X-1)的同源性為98.2%。子一代單倍型(Z-4)與母本2種單倍型(C-1,CC-1)的同源性分別為99.4%、99.8%,與父本單倍型(X-1)的同源性為98.4%。子一代單倍型(Z-5)與母本 2種單倍型(C-1,CC-1)的同源性分別為99.4%,99.6%,與父本單倍型(X-1)的同源性為98.1%(見表 1)。

2.4 COI基因核苷酸序列的變異位點分析

對光倒刺 鲃雜交子代的單倍型與其親本的單倍型進行了序列比對(如圖2)。其中存在堿基的插入與缺失,分別為在第 612位點單倍型(Z-2)插入堿基 G,在第715位點單倍型(C-1,Z-5)插入堿基G,在第745位點單倍型(C-1)插入堿基 C,在第 845位點單倍型(CC-1)插入堿基C,在第856位點單倍型(Z-5)插入堿基 T,在第 879位點單倍型(Z-4)插入堿基 T,在第1556位點單倍型(C-1,Z-5)存在堿基缺失,在第1557位點處單倍型(Z-1,X-1,Z-3)插入堿基C。除了堿基的缺失與插入,還存在堿基的轉換與顛換。在子一代單倍型(Z-1)與其母本 2種單倍型(C-1,CC-1)和父本單倍型(X-1)分析中,發(fā)現(xiàn) 28個變異位點,其中子一代單倍型(Z-1)與母本單倍型(C-1)有 4個變異位點,即在第317、350、758、1214位堿基分別為C、T、A、T,而母本在相應位點分別為T、A、G、C,父本在相應的位點分別為C、T、A、T,子一代單倍型(Z-1)與母本單倍型(CC-1)分析中,發(fā)現(xiàn) 1個變異位點,即在第80位點堿基為A,而母本相應位點分別為G,父本在相應位點為A。在子一代單倍型(Z-4)與母本單倍型(C-1,CC-1)和父本單倍型(X-1)分析中,發(fā)現(xiàn)28個變異位點,其中子一代單倍型(Z-4)與母本單倍型(C-1)有 5個變異位點即在第 317、350、758、975、1214位,堿基為C、T、A、T、T,而母本在相應位點為T、A、G、C、C,父本在相應位點為C、T、A、C、T。在子一代單倍型(Z-4)與母本單倍型(CC-1)分析中共1個變異位點,即在第80位點堿基為A,而母本在相應位點分別為G,父本在相應位點分別為A。在子一代單倍型(Z-5)與母本單倍型(C-1,CC-1)和父本單倍型(X-1)分析中,發(fā)現(xiàn) 30個變異位點,其中子一代單倍型(Z-5)與母本單倍型(C-1)分析中共 5個變異位點,即在第 317、350、758、784、1214位點,堿基分別為C、T、G、C、T,而母本在相應位點為T、A、C、T、C,父本在相應位點為 C、T、C、T、T。在子一代單倍型(Z-5)與母本單倍型(CC-1)分析中發(fā)現(xiàn) 3個變異位點,即在第80、778、784位點,堿基分別為A、G、C,而母本在相應位點分別為G、C、T,父本在相應位點分別為A、C、T。

表1 6組光倒刺鲃COI基因核苷酸同源性Tab.1 The nucleotide homology of COI gene in 6 groups of S.hollandi

2.5 COI基因的系統(tǒng)進化樹分析

3 討論

線粒體基因已廣泛應用于許多生物個體的遺傳變異分析和系統(tǒng)進化方面的研究,其中應用細胞色素氧化酶 I(COI)進行遺傳背景研究的文獻報道已經(jīng)有很多,王太等(2015)分析了 DNA 條形碼在魚類物種鑒定中的應用;黃燕(2014)進行了長江特有魚類DNA條形碼的研究;丁春(2014)通過 COI基因進行了河南四種鳊亞科魚類遺傳差異分析;謝佳燕等(2013)通過COI 鲌基因進行鯉科 屬藥用魚類線粒體的DNA條形碼研究;有學者對東亞特有鯉科類群的DNA條形碼及其系統(tǒng)發(fā)育進行了研究(彭居俐,2007;彭居俐等,2009),利用 DNA 鲌條形碼對鯉科 屬魚類物種進行了鑒定;均表明 COI基因具有良好的物種識別能力和保守性。

對于在魚類中雜交背景的序列變異研究也有很多報道,徐暉等(2 0 0 7)分析了雌性褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)和雄性夏牙鲆(P.dentatus)及其雜交子一代的線粒體DNA 16S rRNA基因部分序列的遺傳特性,發(fā)現(xiàn)雜交子代的16S rRNA序列與母本褐牙鲆的序列是一致的,遵循母性遺傳的規(guī)律。周翰林等(2012)進行了兩種雜交石斑魚子一代及其親本的線粒體 COI基因遺傳變異分析,表明雜交子代遵循母性遺傳的特征。鄭樂云(2014)對云紋石斑魚(Epinephelus moara)和赤點石斑魚(Epinephelus akaara)雜交子一代線粒體相關基因的母性遺傳特征進行了分析,表明雜交子代同樣是嚴格遵循母性遺傳的。然而郭新紅在研究雜交多倍體鯉發(fā)現(xiàn),異源四倍體鯽鯉與其父本鯉和母本紅鯽的線粒體 DNA 16S rRNA是遵循母性遺傳的。但發(fā)現(xiàn)以日本白鯽(Carassium auratus cuvieri)為母本、異源四倍體鯽鯉為父本雜交獲得的三倍體湘云鯽的mtDNA存在父性遺傳現(xiàn)象,說明線粒體 DNA在雜交過程中主要表現(xiàn)為母性遺傳,同時也存在父性遺傳的特殊情況(郭新紅,2004)。對于線粒體DNA的父性遺傳現(xiàn)象在其他物種中也有報道,分別在哺乳動物(Shitara et al,1998;Schwartz et al,2002)、鳥類大山雀(Kvist et al,2003)、比目魚(Platichthys flesus)、昆蟲(Lansman et al,1983;Meusel et al,1993)、貝類(Passamonti et al,2001;Dalziel et al,2002;Hoarau et al,2002)等物種中發(fā)現(xiàn)了不同程度的父性遺傳現(xiàn)象。

圖2 6 組光倒刺 鲃的8種單倍型的mtDNA COI基因核苷酸比對Fig.2 Multiple alignment analysis for mtDNA COI of 8 haplotype in 6 groups of S.hollandi

圖3 鄰接法構建6 組光倒刺 鲃mtDNA COI基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 The Neighbor-joining phylogenetic tree of the mtDNA COI genes from S.hollandi

本研究使用相同引物擴增上述6 組光倒刺 鲃COI基因,通過分析表明雜交子一代光倒刺 鲃COI基因與母本光倒刺的單倍型同源性達到99.4%—99.8%,而與父本光倒刺的單倍型同源性為 98.1%—98.5%(見表 1)。雜交子一代與母本最多的有 9個[子一代單倍型(Z-4)與其母本單倍型(C-1)]位點不同,但是其呈分散分布,這可能是由于其母本 COI基因的個體差異造成的或者由人工育種造成的點突變。研究表明,雖然父母本為同種魚類,但與其母本的變異水平明顯低于與其父本的變異水平,表明光倒刺雜交線粒體COI基因嚴格遵循母性遺傳的規(guī)律。

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