馮光燕，高洪文，張新全，孫果麗，王學敏

（1．中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2．四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系，四川 雅安625014）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種來自近東亞和中亞的優(yōu)質多年生豆科牧草，有“牧草之王”的美譽，兩千多年前由西域傳入中國并開始了人工種植與利用［1］。紫花苜蓿營養(yǎng)價值極高，含有豐富的蛋白質、維生素、礦物質和種類齊全的氨基酸［2］，具有優(yōu)良的適口性、廣泛的適應性和穩(wěn)定的生產(chǎn)力，已經(jīng)成為世界范圍內分布最廣和我國人工種植面積最大的豆科牧草［3］，在我國農(nóng)牧業(yè)發(fā)展中起重要的作用。

維生素E（Vita min E，VE），又名生育酚，1922年由美國加州大學Her bert Evans發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)多年研究，分離出其生物分子結晶，并確定了其化學結構式為C29H50O2［4］。1924年，阿肯色大學的Sure首次命名為Vitamin E（VE）［5］。天然VE可分為生育酚（Toeopher ol）和生育三烯酚（Tocotrienol）兩大類，根據(jù)芳香環(huán)上甲基的位置和數(shù)目的不同每一類又各有α、β、γ及δ四種類型［6］。VE 是一類只能由光合組織合成的脂溶性強抗氧化劑［7－8］，是維持人體和動物多種生理活動的重要物質，其主要功能體現(xiàn)在穩(wěn)定不飽和脂肪酸，使其免受脂肪氧合酶的傷害［9］；清除體內自由基，延緩衰老［10］；保證精子和卵巢發(fā)育，維持正常的生殖功能等［11］，是人體和動物必須從食物中攝取的微量營養(yǎng)成分之一，具有重要的生物學功能［12－13］。VE 不僅在動植物多種生理活動中扮演關鍵角色，而且從農(nóng)業(yè)和營養(yǎng)角度也有很重要的作用。研究認為，VE 作為生物抗氧化劑，可以提高機體免疫反應，抗毒，抗感染，抑制亞硝酸基的形成［14］；肉牛飼養(yǎng)中，添加VE 可以明顯提高肌肉的紅色度，延長肉品的貨架期；奶牛日糧中添加VE可以明顯提高牛奶的品質，抑制牛奶氧化過程，使其保持鮮奶具有的特殊香味并且大幅延長牛奶貯藏時間［15］等。

由于VE不能在人類和動物體內合成，必須通過食物等途徑攝?。?］，而紫花苜蓿作為畜牧業(yè)最重要的豆科牧草之一，研究其VE 的含量及種類分布有非常重要的現(xiàn)實意義。目前，作物VE 的研究主要集中在油菜（Br assica ca mpestris）、水稻（Or yza sativa）、大豆（Gl ycine max）、棉花（Gossy piu m hir－sutu m）等［16－18］，而在重要牧草紫花苜蓿上研究還比較少。因此，本研究通過對16個紫花苜蓿品種葉片中VE含量及VE 各組分分布規(guī)律的研究，以期篩選高VE含量的紫花苜蓿資源，為紫花苜蓿的利用以及品質育種提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗所用的16個紫花苜蓿品種由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源室提供，分別是中苜1 號、雷達克之星、肇東（M．sativa cv．Zhaodong）、草原3號（M．sativa cv．Caoyuan No．3）、阿爾崗金（M．sativa cv．Algonguin）、新牧1 號（M．sativa cv．Xin mu－1）、公農(nóng)2號（M．sativa cv．Gongnong No．2）、甘農(nóng)1 號（M．sativa cv．Gannong No．1）、龍 牧803 （M．sativa cv．Long mu 803）、新疆大葉、三德利（M．sativa cv．Sanditi）、德寶（M．sativa cv．Debao）、烏拉特1 號（M．sativa cv．Wulate No．1）、金皇后（M．sativa cv．Golden Empress）、敖漢和保定（M．sativa cv．Baoding）。

2013年7月11日，每個苜蓿品種各選取50粒形態(tài)完整、大小一致的種子用于測試。種子先于50%乙醇中浸泡2 min，然后于5%的次氯酸鈉中浸泡5 min，滅菌水清洗3 次。將滅好菌的紫花苜蓿種子播種于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿上，置于25 ℃（光／暗為12／12 h）光照培養(yǎng)箱內發(fā)芽，待長出2片葉子后轉移至營養(yǎng)缽中（蛭石∶珍珠巖＝3∶1）于人工氣候室中（光／暗為12／12 h）培養(yǎng)12周，每個品種3盆，每盆混取葉片3 g用于葉片VE含量的測定。

1．2 試驗方法

1．2．1 VE 含量測定 葉片VE 含量委托北京市營養(yǎng)源研究所測定，參照Cahoon等［19］的方法，具體為：混取3 g 新鮮苜蓿葉片，研磨均勻后再取樣0．03～0．05 g，加入1 mL甲醇∶氯仿（2∶1，V∶V）含2，6－二叔丁基對甲酚（BHT）0．01%，避光靜置20 min。加入0．33 mL氯仿和0．6 mL 水，渦旋振蕩，混勻后14 000 g離心10 min，取有機相（下層），蒸干。用二氯甲烷∶甲醇（1∶5，V∶V）溶解至400 μL，置于樣品瓶中上機測定，進樣量20μL。

采用外標法和定量分析測定VE，使用儀器為高效液相色譜儀（型號：Agilent 1260）；雙泵系統(tǒng)（G1312B）；熒光檢測儀（G1321B）；色譜柱為Li－CHrospher 100 Diol 250 mm×4 mm，粒徑5μm；流動相，甲 醇∶水（97 ∶3，V ∶V）；流 速1．2 mL·min－1；熒光激發(fā)292 n m，發(fā)射330 n m。VE標準樣品α－VE，β－VE，γ－VE，δ－VE 購自Sig ma公司。

1．2．2 統(tǒng)計分析 使用SAS 9．2統(tǒng)計軟件中簡單相關分析對維生素E（VE）總量與α－VE，α－VE 與γ－VE數(shù)據(jù)進行相關分析，使用SAS 9．2中ANOVA對不同品種苜蓿VE 含量進行方差分析，Excel 2007進行作圖。

2 結果與分析

2．1 苜蓿品種VE含量分布特征

2．1．1 標準VE 圖譜與標準曲線 測試所得δ－VE，γ－VE，α－VE 標準品分別在8．047，9．712，11．457 min 出現(xiàn)峰值，（圖1－A），以峰面積為縱坐標（Y），維生素E含量為橫坐標（X）計算得到α－VE 校正曲線Y＝6．08 X＋2．10，R2＝0．999 94；γ－VE 校正曲線Y＝3．31 X＋1．55，R2＝0．999 15和δ－VE校正曲線Y＝4．99 X＋0．50，R2＝0．999 08。

對16個苜蓿品種葉片中VE檢測所示，各組分以α－VE 為主，δ－VE 和γ－VE 含量水平較低（圖1－B），因此VE 各組分含量計算與統(tǒng)計以α－VE 和γ－VE為主。

圖1 VE標準品圖譜及樣品VE圖譜Fig．1 HPLC chr omatogram of VE calibr ation standar ds and samples

2．1．2 紫花苜蓿品種VE 總量分析 16個紫花苜蓿品種VE總量介于1．833～6．346 mg·100 g－1FW，平均含量為3．281 mg·100 g－1FW，極差4．513，標準差1．326，變異系數(shù)40．41%。主要分布區(qū)間在1．956～4．607 mg·100 g－1FW，主要分布區(qū)間的品種11個，占參試品種的68．75%。中苜1號VE總含量極顯著高于其他15 個參試苜蓿品種（P＜0．01），達到6．346 mg·100 g－1FW；敖漢苜蓿VE總量最低，僅為1．833 mg·100 g－1FW（表1）。

2．1．3 苜蓿品種主要成分α－VE和γ－VE分析 通過 對參試品 種 的α－VE 和γ－VE 分 析 發(fā) 現(xiàn)，16 個 參試品種葉片中α－VE 含量呈偏態(tài)分布，分布區(qū)域1．471～6．713 mg·100 g－1F W，平均含量3．050 mg·100 g－1F W，頻率變幅1%～16%，標準差1．307，主要分布區(qū)間為1．743～4．361 mg·100 g－1FW，主要分布區(qū)間的品種占總參試品種的72．92%。其中中苜1 號α－VE 含量最高，達到5．992 mg·100 g－1FW，草原3號α－VE含量最低，僅為1．709 mg·100 g－1F W。從在VE 總量中所占的比例來看，參試的16個品種α－VE 含量占到VE總量的89．96%～96．96%，是VE 中的主要組分。其中三德利α－VE所占比例最高，達到98．60%，烏拉特1號α－VE所占比例最低，為89．95%。

16個參試品種葉片中γ－VE 含量呈偏態(tài)分布，分布區(qū)域0．021～0．204 mg·100 g－1F W，平均含0．064 mg·100 g－1F W，頻率變幅1%～17%，標準差0．042，主 要 分 布 區(qū) 間 為0．025 ～0．108 mg·100 g－1F W，主要分布區(qū)間的品種占參試品種的81．82%。其中烏拉特1 號和保定苜蓿γ－VE 含量最高，達到0．147 mg·100 g－1F W，新疆大葉苜蓿γ－VE 含量最低，僅為0．024 mg·100 g－1F W。從在VE總量的比例來看，參試的16個品種γ－VE含量占VE 總量的0．93%～6．84%，遠低于α－VE的含量。

VE總量與α－VE 和γ－VE相關性分析表明，VE總量與α－VE，α－VE與γ－VE含量呈極顯著正相關（P＜0．01），而VE總量與γ－VE含量則無顯著相關關系。

表1 不同品種苜蓿葉片中VE含量分布Table 1 Distribution of VE contents of 16 M．sativa varieties leaves

2．2 高VE苜蓿資源的鑒定

目前國內外尚無關于紫花苜蓿VE含量的分類標準，所以數(shù)據(jù)分析時參照李國營等［20］提出的谷子高VE含量分類標準，以樣品VE 總含量的平均值及其標準差±s，n＝16）為分類依據(jù)，由Excel軟件統(tǒng)計分析，16 份參試品種葉片VE 總量平均值（）為3．281 mg·100 g－1F W，標準差（s）為1．326，則＋s）為4．607 mg·100 g－1F W，－s）為1．955 mg·100 g－1F W。便于統(tǒng)計，計算結果按數(shù)值修約規(guī)則（GB 8170－1987）中0．5單位修約規(guī)定（即將修約間隔指定數(shù)位修約到0．5 單位）修約［20］。得到高VE 總量閾值≥4．61 mg·100 g－1F W，低VE總量閾值≤1．96 mg·100 g－1F W，中等VE 總量閾值為1．96～4．61 mg·100 g－1F W。依據(jù)上述標準，對參試苜蓿品種進行分類（圖2），所有16 個參試苜蓿品種中，VE 總量大于4．61 mg·100 g－1F W 的高VE 苜蓿品種有3個，分別是中苜1號、雷達克之星和新疆大葉苜蓿，占參試品種的18．75%；VE總量在1．96～4．61 mg·100 g－1FW 之間的中等VE苜蓿品種有11個，分別是肇東苜蓿、阿爾崗金、新牧1號、公農(nóng)2號、甘農(nóng)1號、龍牧803、三德利、德寶、烏拉特1號、金皇后和保定苜蓿，占參試品種的68．75%；低于1．96 mg·100 g－1FW 的低VE苜蓿品種有2個，草原3號和敖漢苜蓿，占參試品種的12．5%。

圖2 16個紫花苜蓿品種VE含量及分類Fig．2 Classes and distribution of VE content of 16 M．sativa varieties

3 討論

本研究通過對16個紫花苜蓿品種葉片中所含VE含量進行測定和分析顯示，參試品種中VE 總量介于1．833～6．346 mg·100 g－1F W，平均總含量為3．281 mg·100 g－1F W，與Winifired 等［21］1983年測定的3．122～9．467 mg·100 g－1F W 相比，含量明顯偏低，出現(xiàn)這一差異的原因可能是本研究采用的是新鮮葉片作物測試材料，而Winifred等［21］則通過苜蓿草粉來測試不同品種的VE 含量（新鮮樣品中由于有大量水分可能會影響維生素E的總含量）。Munné－Bosch 等［22］的研究認為，植物不同生長時期體內的VE 含量會呈現(xiàn)明顯的變化，幼苗期植物體內的VE 含量會隨著時間而不斷積累，所以測定VE含量應該注意時期的選擇。

結合我國的苜蓿品種區(qū)域劃分以及各種植區(qū)適宜的苜蓿品種［23］，對參試國內紫花苜蓿品種的VE含量測定結果進行了分析（表2），結果顯示，來自黃淮海苜蓿種植區(qū)的參試品種總VE 含量最高，變異范圍在3．027～6．346 mg·100 g－1F W，平均值為4．687 mg·100 g－1F W；來自內蒙古高原種植區(qū)的參試品種總VE 含量最低，變異范圍在1．833～2．150 mg · 100 g－1F W，平 均 值 為1．959 mg·100 g－1F W。就α－VE 含量而言，同樣是來自黃淮海苜蓿種植區(qū)參試品種的α－VE 含量最高，變異范圍在2．761～5．992 mg·100 g－1F W，平均值為4．377 mg·100 g－1FW；來自內蒙古高原種植區(qū)的參試品種α－VE 含量最低，變異范圍在1．709～1．934 mg·100 g－1FW，平 均 值 為 1．800 mg·100 g－1F W。γ－VE 的分布與α－VE 和總VE的結果相似，同樣是來自黃淮海種植區(qū)的參試品最高，變異范圍在0．059～0．147 mg·100 g－1F W，平均值達0．103 mg·100 g－1F W；與α－VE 和總VE的結果不同的是，γ－VE 含量最低的則是來自青藏高原苜蓿種植區(qū)的參試品種，變異范圍在0．029～0．041 mg·100 g－1F W，平 均 值 僅 為0．035 mg·100 g－1F W ?？梢?，VE 各組分在地域上有較大差異，可能是在苜蓿品種的生長過程中，不同的地域和不同的生態(tài)條件下對其進行遺傳選擇的結果。

Abbasi等［24］研究認為，α／γ－VE 含量的增高可以提高植物對鹽分脅迫的耐受性和抵抗力，郭娟等［25］的研究也表明，在擬南芥（Ar abidopsis thaliana）中過量表達VE 合成關鍵基因以提高VE 含量，增強了擬南芥對鹽分脅迫的耐受能力。而以耐鹽為選育目標的‘中苜1 號’無論是總VE 還是α－VE含量在所有參試品種中都是最高，這也間接的證明VE含量對提高苜蓿對鹽分的耐受能力可能具有積極的作用，VE 含量是否可以作為耐鹽苜蓿篩選的一個參考指標在今后的試驗中可以進行更深入的分析。

表2 不同苜蓿產(chǎn)區(qū)參試品種中VE含量分布以及變異情況Table 2 Distribution and variation of VE contents of M．sativa from different alf alfa－growing areas

本研究還發(fā)現(xiàn)，α－VE是紫花苜蓿葉片中的主要組成 成 分，γ－VE 次 之，δ－VE 所 占 比 例 最 少，并 且α－VE與總VE 呈極顯著正相關關系。由于在人及動 物 體 中α－VE 活 性 最 高［26－27］，而β－VE、γ－VE 及δ－VE的活性遠低于α－VE［28－29］，因此，高α－VE 含量的紫花苜蓿品種能為家畜提供更多的α－VE，從而促進畜產(chǎn)品品質的改善與提高。

本研究通過對紫花苜蓿VE 含量和成分的分析，將參試的紫花苜蓿分成了3類：中苜1號、雷達克之星和新疆大葉苜蓿3個高VE 含量品種，11個中等VE含量的苜蓿品種以及2個低VE 含量的品種，通過對這些苜蓿品種的分類和 含量分布特征的分析，為今后苜蓿品質資源的挖掘和苜蓿品質的改良提供了有益的信息。

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