吳燕燕錢茜茜，2李來(lái)好楊賢慶馬海霞

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

魚類腌制品加工過(guò)程微生物群落多樣性研究進(jìn)展

吳燕燕1錢茜茜1，2李來(lái)好1楊賢慶1馬海霞1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

魚類腌制品是中國(guó)的一種傳統(tǒng)加工水產(chǎn)品，由于其易保存、風(fēng)味特殊、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受大眾喜愛。然而腌制加工過(guò)程中微生物種類復(fù)雜，對(duì)制品的品質(zhì)有較大的影響。結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究闡述了傳統(tǒng)腌制魚和微生物發(fā)酵快速腌制魚中的微生物群落變化、微生物多樣性最新研究技術(shù)及應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上提出了魚類腌制品加工過(guò)程微生物群落多樣性的研究方向，為揭示影響魚類腌制過(guò)程的微生物作用機(jī)制及生產(chǎn)優(yōu)化控制提供理論依據(jù)。

魚類腌制品；微生物多樣性；微生物群落；腌制加工

魚類腌制品具有悠久歷史，不僅原料利用率高，貨架期長(zhǎng)，而且具有香味濃郁，咸鮮相宜的風(fēng)味特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛。著名的魚類腌制品有咸黃魚，咸帶魚，咸鯡魚和海蜇等［1］，腌制過(guò)程有多種微生物參與，許多乳酸菌、微球菌及葡萄球菌能分泌蛋白酶、脂肪酶、氨基酸脫羧酶及硝酸鹽還原酶等，蛋白酶和脂肪酶促進(jìn)原料中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸和多肽，脂肪分解為短鏈的揮發(fā)脂肪酸和酯類物質(zhì)［2］，微生物的代謝產(chǎn)物和原料分解產(chǎn)物共同形成了魚類腌制品特有的風(fēng)味。此外，一些乳酸菌、微球菌和葡萄球菌通過(guò)產(chǎn)酸及抗菌素等途徑能有效抑制魚類腌制品中腐敗菌及病原菌的生長(zhǎng)［3］。但是，氨基酸脫羧酶和硝酸鹽還原酶可將游離氨基酸分解為生物胺，硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，過(guò)量的生物胺曾引發(fā)多起中毒事件［4，5］，亞硝酸鹽可以經(jīng)過(guò)多種途徑合成N-亞硝基化合物，N-亞硝基化合物是致癌物質(zhì)［6］。這兩類物質(zhì)是人們對(duì)水產(chǎn)品安全問(wèn)題關(guān)注的熱點(diǎn)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能在魚肉的發(fā)酵過(guò)程中抑制生物胺和亞硝酸鹽的生成，并且改善腌制品的品質(zhì)，縮短腌制時(shí)間。由此可見，腌制品中風(fēng)味物質(zhì)及有害物質(zhì)的生成與微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，但是目前對(duì)腌制品中微生物的結(jié)構(gòu)和組成缺乏全面而深入的了解，因此存在諸如產(chǎn)品安全性差、質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等問(wèn)題［8］。本文主要對(duì)魚類腌制品加工過(guò)程微生物群落多樣性的研究現(xiàn)狀進(jìn)行闡述，并介紹最新的微生物群落多樣性分析方法，為今后研究各階段微生物種群結(jié)構(gòu)組成，在魚類腌制品品質(zhì)特征形成中的作用，以及這些微生物在維持腌制品質(zhì)量方面所擔(dān)任的角色，如何更好地控制體系中有害微生物的生長(zhǎng)，改善制品風(fēng)味提供參考依據(jù)。

1 魚類腌制品中微生物的分布及多樣性

腌制過(guò)程中魚肉在微生物及其產(chǎn)生的酶類的作用下逐漸失去原有的組織狀態(tài)，肉質(zhì)逐漸變軟，氨基酸氮含量增加，形成魚類腌制品特有的風(fēng)味。魚類腌制加工過(guò)程，有益微生物和有害微生物并存，了解魚類腌制過(guò)程微生物的分布及其多樣性，對(duì)于在加工過(guò)程如何促進(jìn)有益微生物的生長(zhǎng)，有效控制有害微生物的生長(zhǎng)，保證產(chǎn)品的風(fēng)味、品質(zhì)和安全性至關(guān)重要。

1.1 傳統(tǒng)腌制魚中的微生物多樣性

傳統(tǒng)的魚類腌制品主要通過(guò)自然發(fā)酵生成，發(fā)酵過(guò)程中，微生物起到了至關(guān)重要的作用，與腌制品的風(fēng)味物質(zhì)和食用安全性息息相關(guān)。曾令彬等［9］研究了臘魚加工過(guò)程中微生物的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌是臘魚加工中的優(yōu)勢(shì)菌群。梁慧等［10］從傳統(tǒng)臘魚中分離篩選出季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）和近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）兩株產(chǎn)香酵母，這兩株菌在代謝過(guò)程中主要產(chǎn)生醇類和酯類，提高了腌制品的風(fēng)味。陳學(xué)云等［11］從鹽干帶魚中分離得到20株葡萄球菌，其中松鼠葡萄球菌和木糖葡萄球菌可以降解蛋白質(zhì)和脂肪，改善帶魚風(fēng)味。Mah等［12］還發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌可以抑制生物胺在魚類腌制品體內(nèi)的產(chǎn)生。吳燕燕等［13，14］利用從傳統(tǒng)腌制魚中分離純化得到的植物乳桿菌和戊糖片球菌建立了一種有效降低亞硝酸鹽的方法，提高了腌制魚的可食用安全性。并且對(duì)戊糖片球菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出了在接種量4%，pH為6，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h的條件下，酶活性可以提高66%的結(jié)論［15］。曾雪峰等［16］研究了傳統(tǒng)湘西酸魚中乳酸菌的多樣性，結(jié)果表明在發(fā)酵的初始階段，明串珠菌是優(yōu)勢(shì)菌，抑制了不耐酸好氧菌及其他微生物的生長(zhǎng)，后來(lái)由于pH值的降低，耐酸的植物乳桿菌和戊糖片球菌成了酸魚的主要優(yōu)勢(shì)菌群。綜上所述，魚類腌制品中的乳酸菌，酵母菌等微生物可改善腌制品的品質(zhì)，提高可食用安全性，可以作為菌種發(fā)酵劑的來(lái)源廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，但是，在腌制過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)了Citrobacter spp.、Staphylococcu spp.和 Bacillus spp.等，這些菌株能產(chǎn)生組氨酸脫羧酶，將組氨酸分解為組胺［17］，組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺。并且有研究發(fā)現(xiàn)生物胺的積累與微生物種類有密切聯(lián)系［18］。

1.2 微生物發(fā)酵輔助腌制魚中微生物多樣性

乳酸菌是肉制品發(fā)酵劑中研究最早的菌種，在西式火腿［19］、香腸［20］、侗族酸肉［21］和發(fā)酵魚肉［22］等肉制品風(fēng)味形成中起著重要的作用。乳酸菌也是發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物，并能促進(jìn)發(fā)酵魚制品的風(fēng)味形成［23］。有報(bào)道顯示，將乳酸菌人工接種到發(fā)酵魚中，可以明顯改善腌制魚的質(zhì)量和風(fēng)味［24，25］，縮短腌制時(shí)間［26］。當(dāng)前利用的發(fā)酵劑有單一菌種發(fā)酵劑和混合發(fā)酵劑，研究表明單一菌種發(fā)酵效果不如混合菌種發(fā)酵好［27］。所以混合菌種發(fā)酵劑將成為今后魚類腌制品發(fā)酵劑的發(fā)展方向。王乃富等［28，29］研究了乳酸菌輔助發(fā)酵對(duì)鳙魚肉糜菌相的影響，結(jié)果顯示，鳙魚肉糜接種乳酸菌后，細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)明顯高于對(duì)照組，腸桿菌和假單胞菌數(shù)則顯著低于對(duì)照組。謝城等［30］利用混合菌種接種草魚發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的大腸菌群數(shù)明顯低于對(duì)照組，而且沒(méi)有檢出芽孢菌落。蔡敬敬等［31］接種混合乳酸菌對(duì)鰱魚進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期，細(xì)菌和乳酸菌總數(shù)都逐漸增多，細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)菌。發(fā)酵第5天時(shí)，乳酸菌成為了優(yōu)勢(shì)菌，除產(chǎn)生乳酸外，還形成了一些抑菌物質(zhì)，有效地控制了細(xì)菌及腐敗菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵后期，乳酸菌總數(shù)有所減少。此結(jié)果與國(guó)外研究者Yin和Saithong等［32，33］接種混合乳酸菌對(duì)魚肉進(jìn)行發(fā)酵所得到的結(jié)論基本一致。但是目前對(duì)微生物發(fā)酵輔助腌制魚加工過(guò)程中生物胺產(chǎn)生菌的報(bào)道極少，篩選出產(chǎn)生物胺菌株，并對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，從而更好地抑制此類菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步提高魚類腌制品的可食用安全性，是今后研究的重點(diǎn)。

2 腌制食品中微生物群落多樣性研究技術(shù)

目前對(duì)腌制食品中微生物的研究主要還是應(yīng)用傳統(tǒng)的分離、純化、鑒定方法以及進(jìn)行一系列繁瑣的生理生化實(shí)驗(yàn)，但是這種方法并不能對(duì)分離物進(jìn)行精確鑒定，不能反映出分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，無(wú)法獲得微生物多樣性的真正概貌［34］。并且實(shí)驗(yàn)室能夠培養(yǎng)分離出的微生物僅占總量的1%左右［35］，因此免培養(yǎng)的分子生物學(xué)手段，如變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵魚［36］、土壤［37］以及水體環(huán)境［38］中微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性分析中。但DGGE技術(shù)也存在其缺陷，如無(wú)法檢測(cè)環(huán)境中豐度較低的微生物，也難以區(qū)分相似度較高的物種［39］。其他的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、限制性片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）等，雖然結(jié)果具有直觀、可視化的優(yōu)點(diǎn)，但是操作步驟繁多，需要進(jìn)行DNA多種酶切，無(wú)法全面檢測(cè)出樣品中大量尤其是低豐度的微生物。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)對(duì)樣品中微生物基因序列進(jìn)行分析，可很快地確定其中微生物的種類和豐度，同時(shí)衍生出了一門新的學(xué)科——宏基因組學(xué)。1998年，Handelsman等［40］首次提出宏基因組概念：是指在特定環(huán)境樣品中基因組的總和，包含細(xì)菌基因組和真菌基因組。宏基因組學(xué)采用新一代的高通量測(cè)序技術(shù)直接對(duì)樣品中微生物總DNA進(jìn)行測(cè)序，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，不僅可以檢測(cè)到低豐度的微生物，而且速度快，結(jié)果準(zhǔn)確。目前已廣泛應(yīng)用于海洋微生物［41］，土壤微生物［42］和病毒［43］等方面的研究。宏基因組技術(shù)對(duì)于微生物群落的分析主要利用16S rDNA序列，有研究表明16S rDNA高變區(qū)序列得到的物種信息與全序列所得結(jié)果差異不大［44］，且高變區(qū)序列片段更短，在分析大量數(shù)據(jù)時(shí)比較可以提高效率，而且降低了成本。在腌制食品微生物群落多樣性研究方面，基于16S rDNA基因V3區(qū)的宏基因組分析已經(jīng)用于天津傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過(guò)程微生物群落組成和多樣性的研究，結(jié)果清晰地揭示了食醋這一傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀造過(guò)程中豐富的微生物多樣性以及與代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系［45］。但應(yīng)用宏基因組學(xué)技術(shù)研究魚類腌制品中微生物群落多樣性的分析卻未見報(bào)道。

3 展望

魚類腌制品是傳統(tǒng)且大眾喜愛的水產(chǎn)加工食品，由于傳統(tǒng)的加工技術(shù)較落后，產(chǎn)品存在一些安全隱患，如何應(yīng)用現(xiàn)代加工新技術(shù)來(lái)革新魚類腌制品的加工技術(shù)，使其在保證傳統(tǒng)風(fēng)味的基礎(chǔ)上，工藝先進(jìn)且能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品品質(zhì)保證且質(zhì)量安全，已成為當(dāng)前科研工作人員研究的熱點(diǎn)。縱觀已有文獻(xiàn)報(bào)道，以往的研究主要側(cè)重加工工藝的優(yōu)化、揮發(fā)性成分及乳酸菌的功能特性，對(duì)魚類腌制品的微生物群落多樣性及其對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)特征形成規(guī)律的影響等缺乏研究，特別是如何運(yùn)用一種有效的微生物檢測(cè)方法來(lái)研究腌制體系中以乳酸菌為主的微生物群落結(jié)構(gòu)及在腌制過(guò)程中的變化，闡明各階段微生物種群結(jié)構(gòu)組成以及這些微生物在維持腌制品質(zhì)量方面所擔(dān)任的角色，從而更好地控制體系中有害微生物的生長(zhǎng)，改善制品風(fēng)味，也為工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。因此今后研究的重點(diǎn)為：

3.1 探明影響魚類腌制品風(fēng)味品質(zhì)和安全性的微生物種類和分布特點(diǎn)

在魚類腌制品風(fēng)味研究方面，各種魚類腌制品中揮發(fā)性成分研究已比較透徹，魚類腌制品在后熟階段通過(guò)微生物和酶的作用促進(jìn)魚體揮發(fā)性物質(zhì)和前體轉(zhuǎn)化成腌制品中的特征風(fēng)味物質(zhì)。但是，哪些微生物在起這個(gè)作用，這些微生物與一些腐敗微生物之間的一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，如何促進(jìn)我們需要的有益微生物在整個(gè)加工過(guò)程成為優(yōu)勢(shì)菌，并抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。

目前，也有很多學(xué)者致力于將乳酸菌等有益菌接種到魚體中來(lái)加速發(fā)酵的過(guò)程，那么這個(gè)過(guò)程這些有益菌的生長(zhǎng)變化情況，以及代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性的影響也是需要了解的問(wèn)題。另一方面，對(duì)魚類腌制品中產(chǎn)生的亞硝基化合物、生物胺等有害物質(zhì)的控制，這些有害物質(zhì)的產(chǎn)生是哪一類微生物起主要作用及如何抑制，仍然是研究的重點(diǎn)。

3.2 加強(qiáng)宏基因組技術(shù)在微生物多樣性分析中的應(yīng)用研究

傳統(tǒng)的微生物群落鑒別需要經(jīng)過(guò)一系列的分離、純化和繁瑣的生理生化鑒定，時(shí)間較長(zhǎng)，工作量大。隨著微生物分析鑒定技術(shù)的發(fā)展，特別是高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)對(duì)樣品中微生物基因序列進(jìn)行分析，可很快地確定其中微生物的種類和豐度。但此技術(shù)也存在一些問(wèn)題，如在樣品DNA制備方面，目前的DNA提取方法還不能獲得樣品中所有未能培養(yǎng)微生物的全部基因組信息，這直接影響基因組文庫(kù)的構(gòu)建。另外，龐大的DNA序列信息也向我們提出了巨大的挑戰(zhàn)，而生物信息學(xué)的出現(xiàn)則給我們帶來(lái)了極大的便利，在接下來(lái)的研究中，我們需要完善宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)的結(jié)合，進(jìn)而更好地分析宏基因組文庫(kù)中的巨大數(shù)據(jù)。截至今日，人們對(duì)于微生物基因資源的多樣性研究還處于初步階段，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)微生物分析方法對(duì)魚類腌制品中微生物資源進(jìn)行研究勢(shì)在必行。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Diversity of Microbial Community During the Pickled Processing of Salted Fish Products

Wu Yanyan1Qian Xixi1，2Li Laihao1Yang Xianqing1Ma Haixia1
（1. Key Lab of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300；2. College of Food & Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Salted fish is one of traditional aquatic products in China. All along it has been received people’s favor due to its easy preservation， unique flavor and rich nutrition. However， microbial species in pickled processing are complex and have a significant effect on the quality of the products. Combining with the latest researches at home and abroad， here we expound the changes of microbial community in traditional salted fish and fast pickled fish by microbial fermentation， as well as the latest technology and application in microbial diversity researches. On this basis， we propose the research direction on diversity of microbial community during the salted fish processing， and provide the theoretical basis for the researches on microbial action mechanism in salted fish and its optimization control of production.

salted fish；microbial diversity；microbial community；pickled processing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.005

2014-10-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371800），中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助（2014C05XK01），廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（A201301C01）

吳燕燕，女，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制技術(shù)；E-mail：wuyygd@163.com