樊 佳，王雨昊，陶成秋，姜辰陽，王茂林，林宏輝

(四川大學(xué) 生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 成都 610065)

植物生理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)探索

樊 佳，王雨昊，陶成秋，姜辰陽，王茂林，林宏輝

(四川大學(xué) 生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 成都 610065)

應(yīng)對(duì)21世紀(jì)高素質(zhì)綜合型人才的需求，結(jié)合植物實(shí)驗(yàn)教學(xué)的要求，整合驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，開設(shè)“外源一氧化氮對(duì)鹽脅迫下小麥幼苗的影響”實(shí)驗(yàn)。新穎的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容激發(fā)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，充分發(fā)揮學(xué)生的主觀能動(dòng)性，有效地提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。

逆境脅迫；植物生理；綜合性實(shí)驗(yàn)；探索

建設(shè)創(chuàng)新型國(guó)家戰(zhàn)略目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，要求高等教育培養(yǎng)出大批具有創(chuàng)新素質(zhì)的人才[1]。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高等教育的重要組成部分，是抽象與具體、理論與實(shí)踐相結(jié)合的過程，在人才培養(yǎng)中具有理論和其他教學(xué)環(huán)節(jié)不可替代的作用[2]。為了創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)，加快實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的步伐，四川大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心整合植物生物學(xué)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)置、學(xué)生評(píng)價(jià)體系等方面進(jìn)行了一系列探索。

1 研究背景

環(huán)境脅迫(Environmental Stress)是指環(huán)境對(duì)生物體所處的生存狀態(tài)產(chǎn)生的壓力，環(huán)境脅迫的主要形式為溫度、干旱、鹽脅迫等。在鹽脅迫等逆境條件下，植物往往發(fā)生細(xì)胞膜脂的過氧化作用，丙二醛是其產(chǎn)物之一，通常利用它作為膜質(zhì)過氧化指標(biāo)，反映植物細(xì)胞膜脂過氧化程度的強(qiáng)弱。與此同時(shí)，植物體內(nèi)常有游離脯氨酸的積累，其積累量往往與逆境傷害的程度相關(guān)。此外鹽脅迫下，植物體過氧化氫酶(CAT)等活性都會(huì)受到抑制。

一氧化氮NO(Nitric Oxide，NO)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的水溶性和脂溶性小分子物質(zhì)。NO作為一種重要的信號(hào)分子，廣泛參與植物各種生理過程的調(diào)節(jié)，尤其在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。NO植物學(xué)的研究，特別是NO與植物環(huán)境脅迫間關(guān)系的研究就成為植物界研究的熱點(diǎn)之一。硝普鈉SNP(sodium nitroprusside, SNP) 是一種重要的NO 供體，Delle-donne等證明0.5 mmol/ L SNP 約能產(chǎn)生2.0μmol/ L的NO[3]。目前已有研究表明：外源NO能夠明顯提高鹽脅迫等條件下植物組織中脯氨酸含量，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT等一系列保護(hù)酶的活性，降低丙二醛的含量。適當(dāng)濃度的NO 能夠緩解逆境脅迫對(duì)植物的影響，提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)流程

2.1 預(yù)習(xí)報(bào)告的書寫與試劑的配置

學(xué)生在植物生物學(xué)理論課中學(xué)習(xí)了植物逆境生理的相關(guān)背景知識(shí)，以小組為單位，根據(jù)已有知識(shí)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，選擇所需要的脅迫條件、脅迫濃度，各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定方法等，書寫預(yù)習(xí)報(bào)告。教師組織學(xué)生以小組為單位討論實(shí)驗(yàn)方案的可行性，選擇實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的原理、測(cè)定方法、注意事項(xiàng)等。測(cè)定過程要求每項(xiàng)處理材料的每個(gè)指標(biāo)均設(shè)三次重復(fù)，詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程中常見的問題及注意事項(xiàng)。

學(xué)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行藥品配制，列出操作流程圖和注意事項(xiàng)表，如提取時(shí)的材料用量、環(huán)境要求，反應(yīng)時(shí)間，測(cè)定波長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果的單位換算等。本實(shí)驗(yàn)所用的試劑比較多，都是由學(xué)生自己配置完成，其中包括Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，磷酸緩沖液，硝普鈉溶液，茚三酮和硫代巴比妥酸溶液等，一些試劑有特殊的配置要求，教師可進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生自主選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)備、脅迫條件、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線等，體現(xiàn)以學(xué)生為主體的教學(xué)理念，充分發(fā)揮學(xué)生的主觀能動(dòng)性和創(chuàng)造性。在教學(xué)過程中，教師要融入到學(xué)生中，與他們進(jìn)行雙向的交流，在方案設(shè)計(jì)、查閱資料等環(huán)節(jié)上予以指導(dǎo)，針對(duì)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題和錯(cuò)誤，采用提出疑問及提示等方法讓學(xué)生動(dòng)腦筋并運(yùn)用所學(xué)的專業(yè)知識(shí)發(fā)現(xiàn)問題，解決問題[4]。

2.2 小麥幼苗的生長(zhǎng)與處理

2.3 不同處理?xiàng)l件下小麥幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中小麥的萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)均在人工氣候箱中培養(yǎng)；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，處理期間每天更換處理液(處理液每皿60 mL)。取小麥幼苗葉子用于各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定3次。植物體內(nèi)脯氨酸的含量用酸性茚三酮法測(cè)定；丙二醛的含量用硫代巴比妥酸法測(cè)定；過氧化氫酶活力通過H2O2含量的減少量測(cè)定，教師可根據(jù)學(xué)時(shí)適當(dāng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法[3-4]。初步完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)后，教師組織同學(xué)進(jìn)行小組討論，與學(xué)生一起對(duì)實(shí)驗(yàn)方案的可行性進(jìn)行論證。

2.3.1 脯氨酸含量測(cè)定

2.3.2 丙二醛含量的測(cè)定

2.3.3 過氧化氫酶的測(cè)定

精確稱取小麥葉片0.2 g，剪碎放入預(yù)冷的研缽中，加入2～3 mL 4 ℃預(yù)冷的pH 7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，4℃冰箱中靜置10min，取上層澄清液4000 r/min 離心15 min，上清液即為過氧化氫酶粗提取液。將對(duì)照試管中的酶煮沸殺死，取干凈的試管加入粗酶液0.2 mL和1.5 mL 緩沖液(pH=7.8)及1.0 mL的蒸餾水，25 ℃預(yù)熱后，加入0.3 mL 0.1mol/L的過氧化氫，240nm下迅速測(cè)定吸光度，每隔1 min讀數(shù)1次，共測(cè)4 min。測(cè)完后再用0.1 mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余過氧化氫[6]。

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在植物生理實(shí)驗(yàn)中，很多實(shí)驗(yàn)方法和手段都存在各種各樣的誤差，影響了實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)論。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，組織學(xué)生討論本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，分析失敗原因，是提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的有效手段。

脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：100 mmol/ L NaCl單獨(dú)處理時(shí)，小麥葉片中脯氨酸含量顯著高于對(duì)照組，0.02-0.2 mmol/ L SNP能夠不同程度的提高鹽脅迫下，小麥幼苗葉片中脯氨酸的含量，其中0.06 mmol/ L SNP處理下的葉片中脯氨酸的含量最高，0.1 mmol/ L，0.2 mmol/ L SNP處理下的脯氨酸含量數(shù)值基本相同。結(jié)果表明，低濃度的SNP能夠提高鹽脅迫下小麥幼苗中的脯氨酸含量。

丙二醛是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物, 其含量的多少反映了膜脂過氧化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在無SNP 處理時(shí), 100 mmol/ L NaCl 脅迫使小麥幼苗的丙二醛含量明顯增加，但經(jīng)不同濃度的SNP預(yù)處理后，MDA的含量呈顯著下降趨勢(shì)，尤其是濃度為0.2 mmol/ L的SNP預(yù)處理后MDA下降最明顯。說明外源NO 可以緩解鹽脅迫造成的小麥幼苗葉片的膜脂過氧化。

過氧化氫酶(CAT) 活性是反映植物對(duì)活性氧清除能力的重要指標(biāo)。在NaCl脅迫下，植物活性氧不斷增加，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜過氧化而受損，進(jìn)而影響植物的代謝功能。在鹽脅迫條件下，隨著外源 NO濃度的增高，葉片中CAT活性也呈上升趨勢(shì)。

2.5 討論

實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定結(jié)束后，首先，給學(xué)生提出問題，動(dòng)員學(xué)生查閱期刊數(shù)據(jù)庫，學(xué)會(huì)思考研究問題。然后，組織學(xué)生討論：為什么進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)照、輕度、中度和重度四個(gè)實(shí)驗(yàn)處理是否合理?為什么選擇測(cè)定這些生理指標(biāo)? 這些指標(biāo)測(cè)定結(jié)果反映了什么？實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他文獻(xiàn)中的結(jié)果是否一致？將所列問題作為實(shí)驗(yàn)報(bào)告的討論。整個(gè)實(shí)驗(yàn)及討論過程在教師與學(xué)生之間的交互狀態(tài)下進(jìn)行，教師根據(jù)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)及設(shè)計(jì)過程的不同階段，及時(shí)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)及設(shè)計(jì)中的不足以及容易忽視的細(xì)節(jié)，鼓勵(lì)學(xué)生獨(dú)立思考、大膽創(chuàng)新并敢于質(zhì)疑，幫助學(xué)生建立創(chuàng)新的思維方式和科學(xué)的研究方法[7]。

2.6 學(xué)生評(píng)價(jià)體系的建立

3 結(jié)束語

生命學(xué)院所開設(shè)的植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中尚未涉及植物逆境生理方面的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)可作為綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)開設(shè)。整個(gè)試驗(yàn)訓(xùn)練過程當(dāng)中，學(xué)生能夠了解植物生理學(xué)的前沿知識(shí)，鞏固課堂所學(xué)的植物生理試驗(yàn)基本操作，更進(jìn)一步了解植物逆境生理機(jī)制，同時(shí)可以加深學(xué)生對(duì)逆境生理、自由基理論有更好的理解。學(xué)生綜合運(yùn)用植物學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)等知識(shí)，通過實(shí)際動(dòng)手操作，應(yīng)用課堂書本所學(xué)的內(nèi)容，加深對(duì)專業(yè)知識(shí)的理解，擴(kuò)展本專業(yè)涉及到的其他相關(guān)領(lǐng)域知識(shí)，增強(qiáng)對(duì)本專業(yè)的學(xué)習(xí)興趣。本實(shí)驗(yàn)綜合植物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、生物統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析技術(shù)，由學(xué)生自主查閱文獻(xiàn)資料，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，處理數(shù)據(jù)、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果、撰寫實(shí)驗(yàn)論文，為學(xué)生們提供一個(gè)全方位、多層面提高綜合試驗(yàn)素養(yǎng)的平臺(tái)。

[1]龔仁喜，孟小碧，秦鋼年.創(chuàng)新型人才培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的探索與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2006，23(7) ：157-161．

[2]肖愛萍. 綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)淺談[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)論叢，2006，26(7) ：229-231．

[3]樊懷福，郭世榮，李娟，等.外源一氧化氮對(duì)鹽脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志，2007，26(12) ：2045- 2050.

[4]江月玲.植物生理學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)的教學(xué)探討與實(shí)踐[J] .植物生理學(xué)通訊，2007，43(1) ：155-156．

[5]吳雪霞，朱月林，朱為民，等.外源一氧化氮對(duì) NaCl 脅迫下番茄幼苗生理影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(3)：575-581.

[6]程麗萍，劉晉秀，胡青平.外源NO對(duì)鹽脅迫下小麥幼苗葉片丙二醛、葉綠素及氧化酶的影響[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2013，33(6)：1222-1225．

[7]任麗麗，吳濤，許卉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革初探[J]. 實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2010，8(5) ：99-100．

[8]陳剛，張彪 ，王忠，等.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程體系的構(gòu)建[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2011，9(6) ：85- 89.

[9]張玉霞，杜曉艷，賈俊英，等.植物逆境生理的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)與實(shí)踐[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28(4) ：446-449.

Exploration of Comprehensive Experiments in Plant Physiology Teaching

FAN Jia，WANG Yuhao，TAO Chengqiu，JIANG Chenyang，WANG Maolin，LIN Honghui

(Experimental Teaching Center of Biological Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065，China)

In order to explore comprehensive experiment design to plant experiment teaching, response to demand for comprehensive talents of high quality in the 21st century, we set up the experiment“effects of exogenous nitric oxide in wheat seedlings under NaCl stress”. Novel experiment stimulates the enthusiasm of the students, exert students’ subjective initiative, effectively improve the quality of experimental teaching.

stress physiology; plant physiology; comprehensive experiment；exploration

2014-07-04；修改日期: 2014-08-04

四川大學(xué)2013年實(shí)驗(yàn)技術(shù)改革基金資助項(xiàng)目(2013—113)。

樊 佳(1988-)，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的教輔工作。

G642.423;Q945

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2015.03.033