石 軍 褚武英 張建社

(長(zhǎng)沙學(xué)院生物與環(huán)境科學(xué)系, 長(zhǎng)沙 410003)

綜述

肌肉特異表達(dá)microRNA的功能研究

石 軍 褚武英 張建社

(長(zhǎng)沙學(xué)院生物與環(huán)境科學(xué)系, 長(zhǎng)沙 410003)

MicroRNA 作為非編碼小 RNA分子在轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程中扮演重要角色, 已成為當(dāng)前分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。近期已有研究證實(shí), 一些在肌肉細(xì)胞中特異表達(dá)microRNA包括miR-1、miR-206和 miR-133可能對(duì)肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育很關(guān)鍵。眾所周知, 肌肉不僅是機(jī)體重要結(jié)構(gòu)組織和運(yùn)動(dòng)器官,而且還是水產(chǎn)畜牧產(chǎn)品的重要蛋白源。聚焦這些肌肉特異myomiRs在肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育中的功能機(jī)理研究, 不僅有助于揭示某些疾病的分子機(jī)制和解決醫(yī)學(xué)上基因治療難題; 同時(shí)也為畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖提供科學(xué)應(yīng)用理論依據(jù)。綜述我們概括了miR-1, miR-206和miR-133 最新研究進(jìn)展, 這將有助于深入了解其作用于肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育的功能和分子機(jī)制。

肌肉干細(xì)胞(肌衛(wèi)星細(xì)胞); 生長(zhǎng)與發(fā)育; 基因調(diào)控; microRNA

MicroRNAs (miRNAs) 作為內(nèi)源非編碼小RNA分子(–22 bp)與特定基因mRNA的3′ UTR 模板序列互補(bǔ)退火, 從而在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因mRNA的翻譯或促使 mRNA的降解[1]。在人基因組中含有相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄因子的 miRNAs多達(dá)上千種[2]。單個(gè)的 miRNA能夠有多個(gè)靶 mRNA, 并且單個(gè)mRNA可以成為多個(gè) miRNA靶目標(biāo), 這使得調(diào)控潛在基因的表達(dá)更加復(fù)雜多樣。在大多情況下, miRNA微調(diào)基因表達(dá), 但是也是某些基因表達(dá)的開(kāi)關(guān), 參與發(fā)育、新陳代謝和免疫反應(yīng)等多種生物過(guò)程。許多病理現(xiàn)象都與 miRNAs的錯(cuò)誤表達(dá)相關(guān),如癌癥、心血管病、心肌梗塞等[3—6]。因此, miRNA的研究成為近年來(lái)的生命科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。

Bernstein等[7]通過(guò)敲除小鼠 Dicer基因研究了miRNA在發(fā)育過(guò)程中整體功能。眾所周知, Dicer是miRNA的前體(pre-miRNA)加工形成成熟 miRNA (mature miRNA) 這一過(guò)程關(guān)鍵的蛋白, 敲除 Dicer能阻斷功能性成熟miRNA分子的形成。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胚胎7.5d出現(xiàn)致命性后果, 原腸胚形成期發(fā)育停止[7]。 O’Rourke 等[8]、Chen等[9]以及Zhao等[10]采用組織特異的 Dicer 缺失的方法揭示 miRNA是使骨骼肌和心肌準(zhǔn)確形態(tài)發(fā)生所必需的。盡管這些實(shí)驗(yàn)有力地證明了miRNAs在組織和器官發(fā)育和生長(zhǎng)中不可缺少, 但是并沒(méi)有闡明單個(gè) miRNA生物功能和作用機(jī)理。

肌肉細(xì)胞發(fā)育開(kāi)始于中胚層干細(xì)胞響應(yīng)胞外信號(hào)而形成成熟的肌肉細(xì)胞或成肌細(xì)胞。雖然目前的研究已經(jīng)能夠初步解釋參與肌肉細(xì)胞增殖分化信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程, 但是這個(gè)復(fù)雜過(guò)程中很多機(jī)制還不太清楚。最近的研究表明, 一種在脊椎動(dòng)物中高度保守的新的RNA小分子參與肌肉細(xì)胞增殖、分化、收縮和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程, 這種小分子就是肌肉特異的miRNAs[5]。miRNAs 在所有類(lèi)型細(xì)胞都有發(fā)現(xiàn), 而有一些只在特定的組織內(nèi)表達(dá)。在肌肉組織中存在著特異表達(dá)的 miRNAs被稱(chēng)為肌肉 microRNA (myomirs), 如: miR-1、miR-133、miR-206 和miR-208等。這些myomirs可以劃分為不同的家族,主要為miR-1家族和miR-133家族。miR-1家族由miR-1 和 miR-206兩個(gè)亞家族組成; 從低等動(dòng)物線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophila)到高等脊椎動(dòng)物機(jī)體內(nèi)都能發(fā)現(xiàn)進(jìn)化高度保守的miR-1家族成員的表達(dá)。miR-206亞家族目前只發(fā)現(xiàn)一個(gè)成員, 只在骨骼肌表達(dá), 而不在心肌表達(dá)。在線(xiàn)蟲(chóng)和果蠅基因組中只含有單獨(dú)的 miR-1基因, 而在魚(yú)類(lèi)、雞(Gallus gallus)、老鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的基因組中 miR-1亞家族含有兩個(gè)相似的轉(zhuǎn)錄本miR-1-1 和 miR-1-2。盡管他們由不同的基因編碼, 但是成熟態(tài)的 miR-1序列卻完全一致。miR-133家族由miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b 和 miR-133c 等組成, 他們序列高度相似。miR-208作為心肌特異表達(dá)的 microRNA逐漸為人所知, 它由α-MHC 的一個(gè)內(nèi)含子編碼。其他的如miR-128、miR-302、miR-367 和 miR-499可能是潛在的心肌特異的 miRNAs, 但他們的功能還有待進(jìn)一步研究證實(shí)[6]。有意思的是這些肌肉特異的miR-133、 miR-1 和miR-206在基因組上呈雙順?lè)醋訉?duì)(Bicistronic pairs)排列。在家鼠中, miR-1-1 和miR-133a-2基因簇位于2號(hào)染色體上, miR-1-2 和miR-133a-1基因簇位于18號(hào)染色體上, miR-206 和miR-133b基因簇則位于1號(hào)染色體上[11]; 與之對(duì)應(yīng), 人類(lèi)miR-1/133/206基因簇分別位于20、18和6號(hào)染色體上; 雞則位于20、2 和3號(hào)染色體上; 斑馬魚(yú)(Danio rerio)位于23、18、20號(hào)染色體上。值得一提的是斑馬魚(yú)miR-206-2 和miR-133c共同位于17號(hào)染色體上構(gòu)成額外的雙順?lè)醋訉?duì)。雖然這些miR-1 與miR-133 基因簇上位置高度保守, 但是他們種子序列(Seed sequence)不同, 他們功能也各異[11, 12]。

1 Myomirs的調(diào)控

在骨骼生肌細(xì)胞和心肌組織胚胎發(fā)育及肌肉分化過(guò)程中主要有三種肌肉特異的 microRNA 表達(dá),分別為miR-1、miR-206 和 miR-133, 他們受肌肉調(diào)節(jié)因子(Muscle regulatory factors, MRFs)調(diào)控。Sweetman等[12]通過(guò)成纖維細(xì)胞源生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor, FGF) 抑制小鼠C2C12肌肉細(xì)胞的分化, 從而干擾 MRF的活性, 導(dǎo)致 miR-1、miR-206 和 miR-133的表達(dá)受到抑制。此外, 在小鼠和雞胚胎實(shí)驗(yàn)中, 過(guò)表達(dá)MRFs可誘導(dǎo)miR-1 和 miR-206表達(dá)異常, 同時(shí)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除Myf5, 導(dǎo)致miR-1和miR-206表達(dá)缺失[12]。血清效應(yīng)因子(Serum response factor, SRF), 肌細(xì)胞增強(qiáng)子 2 (Myocyte- enhancer factor 2, Mef2) 和MyoD 作為主要的肌原分化調(diào)節(jié)因子, 體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)他們是 miR-1-1和miR-1-2起始所必需的。SRF能夠結(jié)合和激活起始區(qū)域, 在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)敲除 SRF會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源的miR-1-1和 miR-1-2的表達(dá)缺失[13]。盡管早先還沒(méi)有成功敲除小鼠 miR-1基因的報(bào)道, 但通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-1會(huì)導(dǎo)致肌細(xì)胞過(guò)早分化和增殖缺陷最終導(dǎo)致發(fā)育受阻、心室肌壁薄化和心力衰竭等癥狀[13]。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), miR-1通過(guò)靶作用于肌肉分化的壓制者組蛋白去乙?；?4 (Histone deacetylase 4, HDAC4), 從而促使肌肉生成[14]。HDAC4同樣很可能是成骨細(xì)胞分化和骨骼基因形成過(guò)程中miR-140的靶基因[15]。這表明在細(xì)胞分化過(guò)程中, 同一個(gè)基因可成為兩個(gè)或多個(gè)不同的 miRNA的靶基因。此外, miR-1、miR-133和miR-206 反而抑制自身的調(diào)節(jié)因子SRF和 HDAC4等的表達(dá), 形成一個(gè)負(fù)調(diào)控回路[14, 16]。這一負(fù)調(diào)控回路機(jī)制有助于解釋miR-1/206 與miR-133的鮮明差異。過(guò)表達(dá)miR-1首先抑制HDAC4, 隨后抑制MEF2, 增加肌管分化[14]。與此相反, miR-133抑制SRF的表達(dá), 從而增加成肌細(xì)胞增殖, 這一調(diào)控回路機(jī)制或許是胚胎發(fā)育過(guò)程中肌肉細(xì)胞增殖與分化的特異調(diào)控通路[14]。

類(lèi)似的結(jié)果在心肌中研究也有發(fā)現(xiàn), Kwon等[17]和Sokol 等[18]發(fā)現(xiàn)抑制果蠅miR-1會(huì)導(dǎo)致部分心肌細(xì)胞不分化, 而缺失會(huì)導(dǎo)致未分化的肌原細(xì)胞大量積累; 與此相反, 過(guò)表達(dá)miR-1擾亂胚胎心肌結(jié)構(gòu)。有意思的是, 敲除果蠅 miR-1并不影響幼蟲(chóng)肌肉組織的形成和生理機(jī)能, 但是在飼養(yǎng)和生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量肌肉畸形和死亡個(gè)體。因此推斷某些microRNA并非組織分型所必需的, 但是對(duì)隨后組織的增長(zhǎng)和維持不可缺少[18]。在小鼠中也有相似結(jié)果, 過(guò)表達(dá) miR-1, 導(dǎo)致心室細(xì)胞減少, 抑制了Hand2的表達(dá), 致使心力衰竭[14]。缺失miR-1-2, 導(dǎo)致小鼠心臟腫大, 這表明 miR-1-2 負(fù)調(diào)控心肌增殖。在爪蟾( Xenopus laevis)中研究發(fā)現(xiàn), 胚胎注射miR-1后會(huì)導(dǎo)致心肌發(fā)育不正常并且減少心肌細(xì)胞增殖; 當(dāng)注射miR-133, 則發(fā)現(xiàn)心臟高度紊亂, 不能形成心室和心環(huán), 細(xì)胞增殖明顯提高[14]。另有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí), miR-133a是心肌增殖和心臟發(fā)育不可缺少的關(guān)鍵因子, 并研發(fā)現(xiàn)心肌傳導(dǎo)障礙與 miR-1和miR-133的異常表達(dá)有直接關(guān)系[10, 19, 20]。

2 Myomirs參與肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化

脊椎動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)分為限定(Determinate)和非限定(Indeterminate)兩種生長(zhǎng)模式。肌肉限定生長(zhǎng)最典型的代表動(dòng)物就是哺乳類(lèi), 因?yàn)槠鋫€(gè)體大小是有限的; 而魚(yú)類(lèi)肌肉生長(zhǎng)相對(duì)來(lái)說(shuō)是非限定的, 因?yàn)轸~(yú)類(lèi)并沒(méi)有固定的大小, 而有些魚(yú)類(lèi)在整個(gè)生命中都在持續(xù)生長(zhǎng)[21]。這兩種生長(zhǎng)模式最主要的區(qū)別在于肌纖維(Muscle fiber) 的生長(zhǎng)差異。與哺乳類(lèi)不同的是, 魚(yú)類(lèi)之所以表現(xiàn)為非限定生長(zhǎng)主要是因?yàn)轸~(yú)類(lèi)可以通過(guò)補(bǔ)充新的肌纖維 (即為 Hyperplasia)來(lái)增加肌肉量, 同樣也可以增加已有的肌纖維的大小(即為 Hypertrophy)[22, 23]。魚(yú)類(lèi)孵化后期的肌細(xì)胞增殖也即為肌肉的補(bǔ)充過(guò)程使得魚(yú)類(lèi)肌肉生長(zhǎng)模式與其他脊椎動(dòng)物不同, 主要是因?yàn)轸~(yú)類(lèi)出生后肌纖維數(shù)量不是固定的, 而隨后伴隨著的是肌肉纖維的增粗和肥大過(guò)程[24]。魚(yú)類(lèi)肌細(xì)胞來(lái)源于肌肉干細(xì)胞(Satellite cells), 它是提供肌肉生長(zhǎng)和修復(fù)過(guò)程中新肌纖維的細(xì)胞來(lái)源。 由于該類(lèi)細(xì)胞具有自我分化和更新的能力, 因而也被稱(chēng)之為肌肉干細(xì)胞[25]。肌衛(wèi)星細(xì)胞一旦被激活就分化形成肌衛(wèi)星細(xì)胞驅(qū)使的成肌細(xì)胞, 并且進(jìn)一步增生, 分化和融合形成肌管,隨后成熟的肌管形成肌纖維。已有的研究表明, Pax3 和Pax7 的表達(dá)是肌衛(wèi)星細(xì)胞的特異性標(biāo)志。同時(shí),他們?cè)诩⌒l(wèi)星細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[26]。當(dāng) Pax7 基因敲除引起肌衛(wèi)星細(xì)胞凋亡, 繼而導(dǎo)致動(dòng)物出生后個(gè)體瘦小, 甚至幾乎沒(méi)有肌肉再生[27, 28]。Pax3 和 Pax7 作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)節(jié)生肌調(diào)節(jié)因子Myf5和MyoD 的表達(dá), 繼而影響肌細(xì)胞分化。通過(guò)基因表達(dá)和細(xì)胞定位研究揭示, 肌衛(wèi)星細(xì)胞通過(guò)非對(duì)稱(chēng)性細(xì)胞分裂來(lái)維持生肌細(xì)胞的激活和自我更新, 即一部分來(lái)自肌衛(wèi)星分裂的子細(xì)胞維持著干細(xì)胞功能, 而另一些子細(xì)胞則被激活形成肌細(xì)胞進(jìn)而發(fā)育成肌纖維[29—31]。這類(lèi)維持干細(xì)胞特性的子細(xì)胞持續(xù)保持Pax3和Pax7的高量表達(dá), 而已激活進(jìn)入分化肌細(xì)胞階段的子細(xì)胞則高量表達(dá)Myf5 和MyoD。因此, Pax3/Pax7和Myf5/MyoD表達(dá)量的改變是控制肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和激活分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)點(diǎn)[31, 32]。Chen 等[33]發(fā)現(xiàn), 肌衛(wèi)星細(xì)胞分化時(shí) miR-1 和 miR-206顯著上調(diào)表達(dá), 肌肉損傷時(shí)明顯下調(diào)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn), miR-1 和 miR-206促使肌衛(wèi)星細(xì)胞分化是通過(guò)直接抑制靶基因Pax7而發(fā)揮作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí), 抑制 miR-1 和 miR-206提高肌衛(wèi)星的增殖并且增加了 Pax7的蛋白水平。與此相反, 過(guò)表達(dá)miR-1和miR-206 顯性失活突變體(Dominant negative mutant)能夠維持 Pax7的表達(dá), 最終抑制成肌細(xì)胞的分化[33]。

3 Myomirs的靶基因

骨骼肌細(xì)胞發(fā)育源于胚胎中胚層, 成肌細(xì)胞增殖或最終分化成肌管都依賴(lài)此重要階段。McCarthy 等[34, 35]發(fā)現(xiàn), 小鼠錯(cuò)誤表達(dá) miR-206 和 miR-133a會(huì)導(dǎo)致肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)(Dystrophy)[34, 35]。獲得或丟失miRNA靶位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致一些基因表達(dá)失調(diào)而產(chǎn)生疾病。Alex 等[36]發(fā)現(xiàn)在名為T(mén)exel 的羊myostatin基因3′UTR上一位點(diǎn)G突變?yōu)锳后, 恰好暴露成為mir-1 和 mir-206的靶位點(diǎn), 從而使得myostatin表達(dá)受到抑制, 最終導(dǎo)致Texel羊的肌肉粗大, 異常肥胖。miRNA 之所以能夠抑制靶基因的表達(dá)依賴(lài)于mRNA 的3′UTR的識(shí)別位點(diǎn)與miRNA的種子序列相匹配的關(guān)鍵的 7個(gè)堿基長(zhǎng)度的核苷酸, 但是有時(shí)這還遠(yuǎn)不足以有效, 還需要其他的額外的特征才能有效抑制 mRNA的表達(dá)。Andrew 等[37]總結(jié)出識(shí)別序列有效性的 5個(gè)廣譜特性: 即識(shí)別位點(diǎn)附近富含AU核苷酸、附近存在可識(shí)別多個(gè)miRNA(有利于 miRNA協(xié)同作用)位點(diǎn)、與 miRNA 配對(duì)需要13—16長(zhǎng)度的核苷酸殘基、距離mRNA 3′UTR 終止位點(diǎn)至少 15 bp長(zhǎng)度以及 3′UTR 序列偏長(zhǎng)的mRNA的識(shí)別序列位點(diǎn)距離中間部位也相應(yīng)偏遠(yuǎn)。鑒于miRNAs 序列的保守性, 為靶基因的預(yù)測(cè)和鑒定提供了可行性。盡管如此, 但真正已確認(rèn)的靶基因數(shù)量仍然有限。目前在哺乳動(dòng)物中, miRNA-1和miRNA-133已鑒定出與肌肉細(xì)胞增殖和增粗相關(guān)的靶基因分別為Cdk9、Rheb、RASA1、Calmodulin、MEF2A和SRF等; 而cyclinD2、Rho-A、Cdc42、WHSC2、Fstl1、Pola1和Utrn被鑒定為骨骼肌特異表達(dá)的 miRNA-206的靶基因[11]。Yuichiro 等[38]在模式生物斑馬魚(yú)中鑒定出一批miRNA-1和133的靶基因, 如 actr3、arpc4I、arpc5a、arpc5b、bactin1、bactin2、cnn2、cnn3a、cnn3b、coro1c、dctn5、parva、pdlim1、pfn2、pfn2I和TPM3等, 研究表明這些潛在靶基因可能與肌小節(jié)(Sarcomere)肌動(dòng)蛋白(Actin)的組裝相關(guān), 但是并沒(méi)有后續(xù)報(bào)道。Yin 等[39]通過(guò)過(guò)表達(dá)的方法在斑馬魚(yú)中鑒定出mir-133的靶基因,如mps1、cdc37、PA2G4、cx43和cldn5等, 并證實(shí)mir-133限制損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞(Cardiomyocyte)的增殖。在癌癥研究方面, 也鑒定出myomirs 的靶基因, 如mir133a通過(guò)靶基因 Bcl-xL 和Mcl-1能夠抑制骨肉瘤癌細(xì)胞增殖而促使細(xì)胞凋亡[40]; mir133a 還直接作用于靶基因FSCN1而扮演胰腺癌腫瘤壓制者的角色[41]。Mataki等[42]發(fā)現(xiàn)下調(diào)表達(dá)Mir-1/133a 功能基因簇增強(qiáng)肺鱗狀上皮癌細(xì)胞的遷移和入侵, 當(dāng)恢復(fù)正常表達(dá) Mir-1/133a后, 通過(guò)錨定靶基因冠蛋白 1C (Coronin-1C)抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和入侵。Yin 等[43]發(fā)現(xiàn)mir-133a 通過(guò)靶作用于Prdm16 調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞褐色脂肪的分型(Brown adipose determination), 這一研究發(fā)現(xiàn)使得mir-133成為治療糖尿病重要藥物作用靶點(diǎn)。在研究糖尿病性心肌病病例時(shí)發(fā)現(xiàn)下調(diào)mir-1的表達(dá), 會(huì)增加氧化應(yīng)激, 導(dǎo)致糖尿病性心肌功能紊亂, 而接頭蛋白(Junction)成為mir-1的靶蛋白[44]。

4 Myomirs研究展望

至目前, 有關(guān)myomirs 的研究?jī)H僅局限于過(guò)表達(dá)和報(bào)告基因活性檢測(cè)來(lái)確定靶基因這兩種主要研究手段, 而有效的基因敲除技術(shù)手段的運(yùn)用必將極大地提升對(duì)myomirs的系統(tǒng)研究。目前在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)等脊椎動(dòng)物中成功敲除 miRNAs 已有少量報(bào)道。在小鼠中, 敲除 miRNAs后有較為明顯的表型(Phenotype) 的有mir-155、mir-17-92、mir-144、mir-143/145、mir-145、mir-451、mir-140、mir-150、mir-223、mir-375和mir-126等, 而單獨(dú)敲除mir-106、mir-143以及mir-182并沒(méi)有明顯的表型; 與此相似,單獨(dú)敲除mir-208a、mir-208b、mir-499、mir-133a-1、mir-133a-2以及 mir-206也未見(jiàn)明顯的表型[45—50]。有意思的是, 單獨(dú)敲除 mir-1-2 則導(dǎo)致心肌缺陷,大約 50%胚胎致死, 這暗示 mir-1的功能性單倍劑量不足(Haploinsufficiency)。這一結(jié)果表明, mir-1在心肌發(fā)育過(guò)程中的重要性, 而雙敲除mir-1-1和mir-1-2基因成為必須, 將進(jìn)一步揭示心肌發(fā)育機(jī)理[51]。Srivastava[51, 52]實(shí)驗(yàn)室繼敲除小鼠 mir-1-2后, Heidersbach 等[ 52]敲除小鼠mir-1-1。他們發(fā)現(xiàn) mir-1-1突變小鼠呈現(xiàn)與mir-1-2缺失突變體相似的表型。雜合的(Compound) mir-1突變體小鼠在斷奶前無(wú)規(guī)律地死亡歸因于嚴(yán)重的心肌功能障礙(Dysfunction);與此同時(shí) mir-1-null 小鼠肌小節(jié)不正常組裝并且下調(diào)肌球蛋白輕鏈2 (Myosin light chain-2, MLC2)的磷酸化; 細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子(Cytoskeletal regulator) Telokin作為平滑肌限制的(Muscle-restricted)MLC2磷酸化的抑制子與其他平滑肌基因在心肌中異常表達(dá); mir-1壓制 Telokin 通過(guò)直接靶作用于 Telokin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控者 myocardin, 抑制 myocardin的轉(zhuǎn)錄,這些實(shí)驗(yàn)證明 mir-1是心臟發(fā)育所必需的, 而且是通過(guò)調(diào)控平滑肌基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄和效應(yīng)的節(jié)點(diǎn)來(lái)加強(qiáng)條紋肌肉(Striated muscle)的顯型[52]。在哺乳動(dòng)物中, 許多miRNAs 存在基因雙拷貝或高度相似性,使得功能富余和互補(bǔ)。單敲除 mir-133a-1和 mir-133a-2 未見(jiàn)任何明顯的表型; 而同時(shí)敲除導(dǎo)致胚胎發(fā)育延遲和 50%新生小鼠心室中膈缺損(Ventricular septal defect)和心腔擴(kuò)張(Cardiac chamber dilation)而死亡[48]。最新研究表明, 心肌胚胎發(fā)育依賴(lài) miR-1-1/ 133a-2和 miR-1-2/133a-1基因簇的協(xié)調(diào)運(yùn)作, 雙敲除這兩個(gè)基因簇壓制轉(zhuǎn)錄共同激活子心肌素蛋白(Myocrdin)的表達(dá), 而 myocardin是平滑肌(Smooth muscle, SM)基因表達(dá)的主要的調(diào)控者[53]; DAN芯片實(shí)驗(yàn)證實(shí), 敲除mir-1/133a簇導(dǎo)致Kcnmb1、Bmp10、transgelin、myocardin和Acta2等基因顯著上調(diào), 而先前推定的 mir-1/133a的靶基因 Hand2、SRF、IRX5、Ccnd2、Kcnd2和Hdac4的表達(dá)與對(duì)照野生型相比并無(wú)明顯差異。由此可見(jiàn), 先前體外實(shí)驗(yàn)熒光素酶活性檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因的方法的準(zhǔn)確性可見(jiàn)一斑,而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)基因敲除成為研究基因功能的首選。Zhang等[54]和 Miller 等[55]在Nature biotechnology雜志同期報(bào)道了從黃單胞菌(Xanthomonas sp.)中分離和鑒定出一種能對(duì)基因有效修改和編輯的蛋白名為類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)核酶(Transcription activator-like effectors nucleases, TALEN), 其原理主要是通過(guò)TAL effector DNA 結(jié)合區(qū)域和FokI 切割區(qū)域兩個(gè)融合蛋白有效破壞內(nèi)源靶基因。隨后 TALEN技術(shù)相繼被廣泛運(yùn)用于哺乳類(lèi), 兩棲類(lèi)爪蟾的組織細(xì)胞和胚胎基因敲除實(shí)驗(yàn)[56—60]; 而在斑馬魚(yú)中 TALEN技術(shù)已越發(fā)成熟[61—64]。此外, 一種從釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中分離出的核酸內(nèi)切酶Cas蛋白利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也能對(duì)目的基因在基因組準(zhǔn)確位點(diǎn)進(jìn)行有效切割, 此方法有效率高達(dá)30%以上[65—68]。目前此兩種高效的基因敲除技術(shù)紛紛被用于模式生物斑馬魚(yú)基因敲除實(shí)驗(yàn), 生命科學(xué)從而進(jìn)入全新的基因敲除時(shí)代[69, 70], 相信 myomirs的功能將會(huì)得到進(jìn)一步闡釋。當(dāng)前我們承擔(dān)魚(yú)類(lèi)miRNA-1/133a在肌肉發(fā)育與生長(zhǎng)中的功能研究課題, 通過(guò)最新基因敲除技術(shù)建立突變模型, 試圖解釋魚(yú)類(lèi)mir-1/133a基因簇的協(xié)同作用機(jī)制。當(dāng)前斑馬魚(yú)中已有miRNAs敲除的成功報(bào)道, Xiao 等[71]采用CRISPR/Cas9和TALEN系統(tǒng)成功敲除mir-126a/b 和1號(hào), 9號(hào)染色體miRNAs基因簇, 這將為miRNA功能研究提供重要參考價(jià)值和技術(shù)支撐。

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THE FUNCTIONAL STUDIES OF MUSCLE-SPECIFIC MICRORNAS

SHI Jun, CHU Wu-Ying and ZHANG Jian-She
(Department of Biological and Environmental Science, University of Changsha, Changsha 410003, China)

MicroRNAs are small non-coding RNA molecules that play important roles in the transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression. MicroRNAs have become one of the hotspot issues in molecular biology. Recently several microRNAs have been identified including miR-1, miR-206 and miR-133 that are specifically expressed in muscle cells and may be crucially involved in the development and growth of muscles. Muscles are an important part of body structure as well as a locomotive organ, and they are also the main protein source in aquaculture and animal husbandry. Therefore, functional studies of the roles of muscle-specific microRNAs will help uncover the mechanisms of certain diseases, facilitate medical gene therapy, and provide guidance for the animal husbandry and fishery. In this review we summarized the latest research on miR-1, miR-206 and miR-133 that shed lights on better understanding of their functions in muscle development and growth.

Muscle stem cells (satellite cell); Growth and development; Gene regulation; microRNA

Q344

A

1000-3207(2015)06-1224-07

10.7541/2015.159

2014-12-10;

2015-03-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31402271; 31230076)資助

石軍(1983—), 男, 湖北黃岡人; 博士; 主要從事魚(yú)類(lèi)基因調(diào)控研究? E-mail: Junshi@ccsu.edu.cn, Junshistone@gmail.com

張建社, 男, 湖南長(zhǎng)沙人; 教授; 主要從事魚(yú)類(lèi)肌肉發(fā)育與基因調(diào)控研究。E-mail: jzhang@ccsu.cn