李芳，李雪梅，李獻(xiàn)剛，于鳳嬌，陳瑩，孫沛（國(guó)家級(jí)農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東港出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧東港118300）

貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法研究概況

李芳，李雪梅，李獻(xiàn)剛，于鳳嬌，陳瑩，孫沛
（國(guó)家級(jí)農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東港出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧東港118300）

摘要：主要針對(duì)腹瀉性貝毒（DSP）、麻痹性貝毒（PSP）、神經(jīng)性貝毒（NSP）、記憶缺損性貝毒（ASP）和藍(lán)藻毒素5類(lèi)主要貝類(lèi)毒素，著重介紹分析檢測(cè)方法和儀器分析技術(shù)，同時(shí)介紹這5類(lèi)毒素的相關(guān)概況及限量要求。

關(guān)鍵詞：貝類(lèi)毒素；性質(zhì)；檢測(cè)方法；限量

貝類(lèi)毒素的形成與海洋中有毒藻類(lèi)赤潮密切相關(guān)，屬于海洋天然有機(jī)物，20世紀(jì)以來(lái)，赤潮在世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，貝類(lèi)通過(guò)濾食有毒微藻（主要是藻黃素），經(jīng)過(guò)生物累積和放大轉(zhuǎn)化為貝類(lèi)毒素，水體的富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水體中藻類(lèi)的過(guò)度繁殖，最終在貝類(lèi)體內(nèi)形成毒素進(jìn)入到社會(huì)部分流通領(lǐng)域，依據(jù)赤潮生物對(duì)其他生物的作用情況可將赤潮分為3類(lèi)：（1）無(wú)毒赤潮；（2）對(duì)人無(wú)毒，但對(duì)魚(yú)類(lèi)及無(wú)脊椎動(dòng)物有毒的赤潮；（3）有毒赤潮。在有毒赤潮中，赤潮毒素作用于人類(lèi)消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)或心血管系統(tǒng)，引起中毒，威脅人類(lèi)健康，這類(lèi)赤潮最應(yīng)引起重視。同時(shí)由于貝類(lèi)毒素對(duì)人的危害已經(jīng)被關(guān)注，對(duì)這些有害毒素的檢測(cè)也逐漸受到各類(lèi)專(zhuān)家的重視，本文著重介紹各類(lèi)毒素的分析檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)介紹一些相關(guān)性質(zhì)及限量要求，展望對(duì)貝類(lèi)毒素檢測(cè)手段，檢測(cè)種類(lèi)。

1　貝類(lèi)毒素性質(zhì)

1.1腹瀉性貝毒（DSP）

腹瀉性貝毒是由甲藻產(chǎn)生的，屬于鰭藻屬和原甲藻屬[1]，可引起人類(lèi)腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀，是從各種貝類(lèi)和甲藻中分離出來(lái)的一類(lèi)脂溶性物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物。根據(jù)這些成分的碳骨架結(jié)構(gòu)可以將它們分成酸性成分、中性成分和其他成分3種。目前發(fā)現(xiàn)的腹瀉性貝毒約有12種，其中9種結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，分為中大田軟海綿酸（OA）及其衍生物鰭藻毒素（DTX-3）；大環(huán)內(nèi)酯貝毒素-（1 PTX-1）、PTX-2、PTX-3、PTX-6；磺化毒物、紫夷貝毒素（YTX）及其衍生物三大類(lèi)。毒性機(jī)制主要在于其活性成分OA能夠抑制細(xì)胞質(zhì)中磷酸酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)磷酸化，從而對(duì)生物的多種生理功能造成影響。歐盟（EU）對(duì)在市場(chǎng)流通的鮮活貝類(lèi)及貝類(lèi)產(chǎn)品要求腹瀉性貝毒在整體數(shù)量上含有的海洋生物毒素（以整體或各個(gè)可食用部分來(lái)計(jì)量），采用生物法（BTM）分析時(shí)，不能為陽(yáng)性結(jié)果，或以大田軟海綿酸、鰭藻毒素和扇貝毒素一起計(jì)算，大田軟海綿酸等價(jià)物≤160 μg/kg。食品和藥物管理局（FDA）規(guī)定最大檢出量為0.2 mg/kg。

1.2麻痹性貝毒（PSP）

麻痹性貝毒已經(jīng)成為世界上分布最廣，事故發(fā)生頻率最高，危害程度最大的一類(lèi)毒素[2]。麻痹性貝類(lèi)毒素主要來(lái)源于藻類(lèi)，也有人提出貝類(lèi)毒素源于細(xì)菌。其毒性很強(qiáng)，相當(dāng)于河豚毒素的毒性。目前已分離出20種麻痹性貝類(lèi)毒素，分為石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neo-STX）、膝溝藻毒素（GTX）3大類(lèi)。麻痹性貝毒是一類(lèi)神經(jīng)性毒素，為二代鹽，分子量低，白色，極性比較高，不揮發(fā)，易溶于水、微溶于甲醇和乙醇，不溶于非極性溶劑。在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下可發(fā)生氧化，導(dǎo)致毒性降低甚至消失。遇熱穩(wěn)定，不能被人體中的消化酶所破壞[3]。麻痹性貝類(lèi)毒素是細(xì)胞膜鈉離子通道高度專(zhuān)一性阻滯劑，可阻滯神經(jīng)細(xì)胞的興奮和傳導(dǎo)，使人中毒的范圍在600 Mu～5 000 Mu之間（Mu為毒力單位，1 Mu是指使18～229的小白鼠在15 min內(nèi)死亡的毒力），致死劑量為3000Mu～30000Mu?？墒怪卸菊咴?4 h內(nèi)肌肉麻痹、呼吸困難、缺氧昏迷甚至窒息而死亡。目前尚無(wú)麻痹性貝類(lèi)毒素特效藥，所以只能利用各種檢測(cè)手段，阻斷毒素對(duì)人類(lèi)安全造成的危害。歐盟對(duì)在市場(chǎng)流通的鮮活貝類(lèi)及貝類(lèi)產(chǎn)品要求麻痹性貝毒在整體數(shù)量上含有的海洋生物毒素（以整體或各個(gè)可食用部分來(lái)計(jì)量）不得超過(guò)80 μg/ 100 g石房毒素等價(jià)物。

1.3神經(jīng)性貝毒（NSP）

神經(jīng)性毒素的毒性相對(duì)較小，這類(lèi)毒素屬于含有脂溶性的多醚化合物，不含氮，是一種去極化物質(zhì)。它可以打開(kāi)細(xì)胞膜上電壓門(mén)控的鈉離子通道，尤其在細(xì)胞膜內(nèi)電位處于超極化狀態(tài)時(shí)，使鈉離子不可控地大量?jī)?nèi)流，從而使細(xì)胞膜持續(xù)處于去極化狀態(tài)，進(jìn)而引起平滑肌的持續(xù)收縮[4-5]。神經(jīng)性貝毒是唯一一類(lèi)可以通過(guò)吸入導(dǎo)致中毒。人誤食含有神經(jīng)性貝毒的食物時(shí)，主要癥狀是神經(jīng)麻痹。其潛伏期較短，一般為數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)，中毒者主要表現(xiàn)為唇、舌頭、喉頭及面部有麻木感與刺痛感、肌肉疼痛、頭暈等神經(jīng)性癥狀及某些消化道癥狀。疾病持續(xù)的時(shí)間一般為幾天，很少出現(xiàn)死亡情況[6]。目前，對(duì)新鮮的、冷凍的或罐裝制品的牡蠣、蛤類(lèi)和貽貝的神經(jīng)性貝類(lèi)毒素最大允許限量為20 Mu/100 g。

1.4記憶缺失性貝毒（ASP）

軟骨藻酸能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合氨基酸受體，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬區(qū)和丘腦區(qū)以及記憶有關(guān)區(qū)域的損傷，導(dǎo)致記憶喪失。記憶缺失性貝毒的主要毒素成分為軟骨酸藻（Domoic acid，DA），它是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性非蛋白氨基酸，由長(zhǎng)鏈羽狀硅藻代謝產(chǎn)生的一種物質(zhì)。歐盟和國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)為20 mg/kg貝肉組織。

1.5藍(lán)藻毒素

藍(lán)藻毒素是由水體中藍(lán)綠藻產(chǎn)生的一類(lèi)具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，此類(lèi)毒素易溶于水，甲醇或丙酮，不揮發(fā)，抗pH變化溶于水，化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，在水中降解十分緩慢，且耐高溫，不揮發(fā)，耐酸堿，它是一種肝毒素，這種毒素是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑。微囊藻毒素是藍(lán)藻產(chǎn)生的一類(lèi)天然毒素，目前認(rèn)為藍(lán)藻毒素暴露的途徑主要包括：皮膚接觸、呼吸道吸入、血液透析和消化道攝入，實(shí)際上這些途徑可能同時(shí)發(fā)生[7]。世界衛(wèi)生組織推薦的限量為每升1 μg。

2　檢測(cè)方法

2.1小鼠分析法

小鼠分析法是應(yīng)用最多的貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法，此方法對(duì)于檢測(cè)腹瀉性貝毒、麻痹性貝毒、神經(jīng)性貝毒、記憶缺損性貝毒和藍(lán)藻毒素都可以采用，是生物學(xué)檢測(cè)的主要采用的方法。這種方法已經(jīng)被美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of American Analytical Chemists，AOAC）確定為對(duì)PSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)程序，以鼠單位（Mouse unit，Mu）表示，其檢測(cè)限為4 Mu/g，另有DSP的檢測(cè)限為0.05 Mu/g，但是這種方法對(duì)各種藻毒素的檢測(cè)還沒(méi)有統(tǒng)一[8]的認(rèn)識(shí)和標(biāo)準(zhǔn)。此方法是針對(duì)毒素的功能，而不是毒素的結(jié)構(gòu)，所以只能檢測(cè)毒素的有無(wú)及大小，不能判斷是何種毒素，以及準(zhǔn)確的含量，同時(shí)該方法的不確定性非常多，操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，測(cè)試所需時(shí)間較長(zhǎng)。

2.2酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是利用抗原與抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對(duì)各類(lèi)毒素抗體的捕捉抗體，加入酶標(biāo)記物，游離的酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)毒素抗體，同時(shí)毒素抗體與捕捉抗體連接，取出多余的酶標(biāo)記物，將底物和發(fā)色劑加入到孔板中孵育顯色，通過(guò)對(duì)特定吸收波長(zhǎng)的吸收強(qiáng)度比對(duì)，對(duì)毒素進(jìn)行定性定量的檢測(cè)。此方法具有專(zhuān)一性強(qiáng)、使用方便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前，已經(jīng)有多種針對(duì)大田軟海綿酸、膝溝藻毒素等貝類(lèi)毒素檢測(cè)的商品化試劑盒。酶聯(lián)免疫法測(cè)試的檢出限相對(duì)較低，其檢測(cè)毒素的檢出低限可至pg/g級(jí)，如腹瀉性貝類(lèi)毒素（岡田酸）水樣檢測(cè)限為0.05 ng/mL，貝類(lèi)樣品檢測(cè)限為0.1 ng/g；麻痹性貝類(lèi)毒素檢測(cè)限為0.02 ng/g；神經(jīng)性貝類(lèi)毒素檢測(cè)限為0.01 ng/g；記憶缺失性貝類(lèi)毒素（軟骨藻酸）檢測(cè)限為0.5 ng/g；藍(lán)藻毒素（微囊藻毒素）檢測(cè)限為0.1 ng/g。但由于貝類(lèi)毒素種類(lèi)繁多，目前的商品化試劑盒檢測(cè)貝類(lèi)毒素種類(lèi)較少，對(duì)很多貝類(lèi)毒素缺乏有效的免疫監(jiān)測(cè)手段，免疫檢測(cè)只能根據(jù)待測(cè)物結(jié)構(gòu)表位進(jìn)行測(cè)定，而非針對(duì)其結(jié)構(gòu)，因此其類(lèi)似物有干擾作用，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或?qū)Χ拘怨烙?jì)的不準(zhǔn)確，同時(shí)試劑盒價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模推廣使用。

2.3高效液相色譜-熒光檢測(cè)法

高效液相色譜-熒光檢測(cè)法方法是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)腹瀉性貝毒和麻痹性貝毒的常用方法，其主要原理是利用合適的溶劑提取樣品中的待測(cè)物質(zhì)，去除樣品中一并提取出的雜質(zhì)，加入衍生化試劑，通過(guò)衍生作用使待測(cè)化合物在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下能夠產(chǎn)生熒光，利用熒光強(qiáng)度計(jì)算含量，從而進(jìn)一步進(jìn)行定性、定量研究。幾乎所有的貝類(lèi)毒素都能使用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間較生物檢測(cè)法短，配合液相色譜系統(tǒng)的自動(dòng)進(jìn)樣器能夠完成大批樣品的檢測(cè)任務(wù)，對(duì)于麻痹性貝類(lèi)毒素利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法，其檢測(cè)低限一般在6.5 μg/kg～129 μg/kg，完全可以滿(mǎn)足限量要求。不過(guò)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法對(duì)于結(jié)構(gòu)相似，保留時(shí)間基本相同的同系貝類(lèi)毒素定性能力較差，分析使用的衍生化試劑較昂貴，有些熒光化試劑不穩(wěn)定，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.4毛細(xì)電泳法

毛細(xì)管電泳法，還不是常規(guī)水體檢測(cè)藻類(lèi)毒素的技術(shù)。具有柱上富集作用，分析速度快，效率高，已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。但是相對(duì)比較此方法靈敏度不夠高，為1 mg/L。也有報(bào)道衍生藻毒素為熒光化合物，應(yīng)用激光誘導(dǎo)熒光監(jiān)測(cè)器可提高靈敏度，但此法還不成熟。此方法經(jīng)過(guò)不斷地改善，有望成為操作簡(jiǎn)單，快速的各種貝類(lèi)毒素常規(guī)檢測(cè)方法。

2.5高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于貝類(lèi)毒素檢測(cè)工作中，此方法具有檢出限低、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量結(jié)果準(zhǔn)確，由于貝類(lèi)毒素已經(jīng)有商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品，所以對(duì)貝類(lèi)毒素的檢測(cè)方法也已經(jīng)向液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法發(fā)展，目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于使用該方法檢測(cè)貝類(lèi)毒素含量的報(bào)道越來(lái)越多，也有利用該方法針對(duì)某一種貝類(lèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于記憶缺失性貝毒利用該方法檢測(cè)的檢出限為100 μg/kg，但是該方法還沒(méi)有形成一套完整的針對(duì)多種貝類(lèi)毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。雖然此方法可以準(zhǔn)確的定性、定量，不過(guò)得以實(shí)施的基礎(chǔ)是分離純化的貝類(lèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，由于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品種類(lèi)有限，所以該方法也有一定的局限性。

2.6其他方法

除了上述5種主要方法，對(duì)于貝類(lèi)毒素的檢測(cè)方法還包括薄層色譜法，氣相色譜法，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，高效液相色譜-紫外檢測(cè)器等相關(guān)方法，同時(shí)酶活性抑制檢測(cè)技術(shù)、生物傳感器檢測(cè)技術(shù)、分子探針技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、重組質(zhì)粒技術(shù)等也在貝類(lèi)毒素檢測(cè)的過(guò)程中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

3　結(jié)語(yǔ)

近二十年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)了貝類(lèi)毒素的存在與危害，重視赤潮給海洋帶來(lái)的污染，同時(shí)也不斷想辦法研究對(duì)其檢測(cè)方法，以及解決方法，隨著研究的深入，會(huì)有愈來(lái)愈多的貝類(lèi)毒素被發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)方法越來(lái)越完善，越來(lái)越統(tǒng)一，并且向著定性、定量快速準(zhǔn)確、低成本，高自動(dòng)化的方向發(fā)展。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.048

收稿日期：2014-06-25

作者簡(jiǎn)介：李芳（1984—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：分析檢測(cè)。

Research on Progress of Determination of Shellfish Toxin

LI Fang，LI Xue-mei，LI Xian-gang，YU Feng-jiao，CHEN Ying，SUN Pei
（National Level Key Laboratory of Veterinary Drug，Pesticid Residue＆Marine Life's Toxin Detection，Donggang Entry-Exit Inspection＆Quarantine Bureau，Donggang 118300，Liaoning，China）

Abstract：This article mainly aims at five kinds of shellfish toxins，including diarrhea shellfish poisoning （DSP），paralytic shellfish poisoning（PSP），neurotoxic shellfish poisoning（NSP），amnesic shellfish poisoning （ASP）and cyanophyta toxin，introduced emphatically analytical method，instrument analysis technology，the general situation and the limited requirements of them.

Key words：shellfish poisoning；characteristic；analytical method；limited