郭洪輝，王安，洪專，*（.國(guó)家海洋局第三海洋所，海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建廈門36005；.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙40083）

河豚魚皮膠原寡肽的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

郭洪輝1，王安2，洪專1，*
（1.國(guó)家海洋局第三海洋所，海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建廈門361005；2.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410083）

摘要：以河豚魚皮作為原料，采用兩步酶解法制備河豚魚皮膠原寡肽，分子量分布主要集中在100 u～1 000 u。根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》和《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，利用動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)河豚魚皮膠原寡肽的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。急性經(jīng)口、經(jīng)皮毒性試驗(yàn)選用SD大鼠，大鼠經(jīng)口LD50＞5 000 mg/kg，經(jīng)皮LD50均＞2 000 mg/kg；皮膚、眼刺激試驗(yàn)選擇健康白色家兔，皮膚刺激強(qiáng)度平均分值為0，平均眼刺激積分指數(shù)（I.A.O. I）為0，眼刺激平均指數(shù)（M.I.O.I）48 h為5。皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗(yàn)選用豚鼠，致敏強(qiáng)度為Ⅰ級(jí)。

關(guān)鍵詞：河豚；膠原寡肽；急性毒性試驗(yàn)；毒理學(xué)；安全性評(píng)價(jià)

膠原肽是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，膠原肽具有多種生理調(diào)節(jié)功能，如改善皮膚水分、促進(jìn)傷口愈合、抗皮膚老化[1]、抗氧化、抗高血壓[2]、降血脂[3]等，已在化妝品、保健食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。海洋生物尤其是海洋魚類的皮膚、鱗片及骨正成為膠原肽的新的主要來(lái)源[2，4]。近年來(lái)，利用魚皮等下腳料，制備出具有各種生理功能的膠原肽已有文獻(xiàn)報(bào)道[5-10]，但鮮見有對(duì)膠原肽進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)報(bào)告。本文在以河豚魚皮為原料制備膠原寡肽的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，了解膠原寡肽急性經(jīng)口、經(jīng)皮的毒性效應(yīng)，觀察膠原寡肽對(duì)眼、皮膚的刺激或腐蝕作用大小以及對(duì)皮膚變態(tài)反應(yīng)性，初步估測(cè)毒作用的靶器官和可能的毒作用機(jī)理，為亞慢性、慢性和其他毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供參考，為河豚魚皮膠原寡肽用作護(hù)膚用品或保健品的功能性因子的開發(fā)方面提供試驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試劑

河豚魚皮：購(gòu)于福建漳州水產(chǎn)品加工廠；Superdex peptide 10/300GL凝膠分析柱：美國(guó)GE公司；魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶（105U/g）、酸性蛋白酶（104U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：美國(guó)sigma公司；Epsilon 2-6D凍干機(jī)：德國(guó)Christ公司。

1.2儀器

30L雙層玻璃反應(yīng)釜、DFY-20L/20低溫恒溫反應(yīng)?。红柫x市予華儀器有限責(zé)任公司；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；管式離心機(jī)：上海浦東天本離心機(jī)有限公司；SG2便攜式pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；AKTA全自動(dòng)蛋白層析系統(tǒng)：美國(guó)GE公司。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

受試動(dòng)物購(gòu)自湖南省天勤生物技術(shù)有限公司，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2009-0012號(hào)。試驗(yàn)前常規(guī)檢疫1周后，選擇符合要求的動(dòng)物投入試驗(yàn)。急性經(jīng)口、經(jīng)皮毒性試驗(yàn)選用SD大鼠，體重為180 g～220 g，雌雄各半；皮膚、眼刺激試驗(yàn)選擇健康白色家兔，體重2.0 kg～2.5 kg，雌雄各半。皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗(yàn)選用豚鼠40只，體重250 g～300 g，雌雄各半。

1.4河豚魚皮膠原寡肽的制備[11]

5 kg河豚魚皮，依次采用酸堿液處理后，洗至中性，加入5 L純水，60℃恒溫加熱攪拌提取2 h后，冷卻至室溫，以管式離心機(jī)過(guò)濾除渣，得到河豚魚皮的膠原提取液。膠原提取液分別經(jīng)魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶和酸性蛋白酶兩次酶解后，得到河豚魚皮膠原寡肽提取液，凍干后為淡黃色的河豚魚皮膠原寡肽粉末。

1.5河豚魚皮膠原寡肽的分子量測(cè)定

采用AKTA全自動(dòng)蛋白層析系統(tǒng)對(duì)膠原寡肽的分子量分布進(jìn)行測(cè)定。以50 mmol/L磷酸鹽、0.15mol/L氯化鈉、pH 7.0的緩沖液為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量50 μL。圖1為5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量分布圖。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量分布Fig.1　Molecular weight distribution of standard proteins

采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)值對(duì)洗脫體積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：lgMr=-0.246v+6.669 7（R2= 0.995 9），式中：v為洗脫體積；Mr為分子量。通過(guò)洗脫體積計(jì)算膠原寡肽的分子量分布，并用峰面積歸一法計(jì)算不同分子量范圍肽的相對(duì)百分比。

1.6成分測(cè)定

取河豚魚皮膠原寡肽凍干粉，測(cè)定其基本成分。蛋白含量的測(cè)定：GB5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；灰分的測(cè)定：GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》；水分的測(cè)定：GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》。

1.7動(dòng)物試驗(yàn)方法[12-13]

1.7.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

測(cè)定最大耐受劑量，按5 000 mg/kg體重染毒。取SD大鼠20只，體重（187.72±3.95）g，雄雌各半，隔夜禁食。取適量受試物用蒸餾水配成所需濃度溶液，一次灌胃給藥，觀察動(dòng)物給藥后14 d的中毒癥狀及死亡情況。

1.7.2急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，正式試驗(yàn)測(cè)定最大耐受劑量，按2 000 mg/kg體重染毒。取SD大鼠20只，體重（223.53±3.45）g，雌雄各半，給藥前24 h將大鼠背部去毛，面積為4cm×5cm。直接涂敷受試物于去毛區(qū)，持續(xù)時(shí)間為4 h，觀察給藥后14 d的中毒癥狀及死亡情況。

1.7.3急性皮膚刺激試驗(yàn)

白色家兔4只，雌雄各半，體重（2.5±0.1）kg，試驗(yàn)前24 h將家兔背部?jī)蓚?cè)的毛剪去，左右兩側(cè)去毛面積均約2 cm×3 cm，以左側(cè)為涂藥區(qū)，右側(cè)為對(duì)照區(qū)。分別取0.5 g受試物，用少許蒸餾水潤(rùn)濕涂敷于涂藥區(qū)，持續(xù)時(shí)間為4 h。對(duì)照區(qū)涂以等量蒸餾水。處理后觀察皮膚刺激反應(yīng)，觀察期一般不超過(guò)14 d。

1.7.4眼刺激試驗(yàn)

白色家兔4只，雌雄各半，體重2.0 kg～2.5 kg，以左眼為給藥眼，右眼為對(duì)照眼。分別取受試物0.1 g，撒入動(dòng)物左眼結(jié)膜囊內(nèi)，立即輕輕閉合眼瞼約1 min；對(duì)照眼給予等量生理鹽水。觀察動(dòng)物受藥后1、24、48、72 h眼結(jié)膜、虹膜和角膜的刺激損傷和恢復(fù)情況。

1.7.5皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗(yàn)

豚鼠20只，體重250 g～300 g，分為染毒組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。致敏接觸：試驗(yàn)前24 h將動(dòng)物背部左側(cè)去毛3 cm×3 cm，分別取受試物0.2 g，用少許蒸餾水潤(rùn)濕敷貼于去毛區(qū)，持續(xù)6 h，第7天和14天以同樣方法重復(fù)一次；激發(fā)接觸：試驗(yàn)前24 h將動(dòng)物背部右側(cè)去毛2 cm×2 cm，末次致敏后14 d，取受試物0.1 g，用少許蒸餾水潤(rùn)濕敷貼于去毛區(qū)，持續(xù)6 h，每日觀察至第12天。陰性對(duì)照組僅給予激發(fā)接觸。

2　結(jié)果與討論

2.1分子量及成分分析

圖2為河豚魚皮膠原寡肽的分子量分布圖。

圖2　河豚魚皮膠原寡肽的分子量分布Fig.2　Molecular weight distribution of collagen peptides from puffer fish skin

從圖2中可以看到，制備的河豚魚皮膠原寡肽的分子量集中分布在100 u～1 000 u之間。經(jīng)測(cè)定，膠原寡肽凍干樣品的蛋白含量為87.3%，灰分為1.1%，水分為3.88%。

2.2安全性試驗(yàn)

2.2.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

經(jīng)口給藥后，河豚魚皮膠原寡肽對(duì)SD大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 膠原寡肽對(duì)SD大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1　Results of acute oral toxicity tests of collagen oligoeptide on SD rats

受試大鼠未見異常，在14 d觀察期內(nèi)受試大鼠無(wú)死亡及其它異常，雌、雄性大鼠經(jīng)口LD50＞5 000 mg/kg（表1）。

2.2.2急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)

表2為河豚魚皮膠原寡肽對(duì)SD大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)結(jié)果。

表2 膠原寡肽對(duì)SD大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of acute dermal toxicity tests of collagen oligoeptide on SD rats

從試驗(yàn)結(jié)果可以看到，經(jīng)皮給藥后，受試大鼠未見明顯異常，在14 d觀察期內(nèi)受試大鼠無(wú)死亡及其它異常。雌、雄性大鼠經(jīng)皮LD50均＞2 000 mg/kg（表2）。

2.2.3皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果

給藥4 h后動(dòng)物涂藥區(qū)局部皮膚未見紅斑、水腫。在7 d觀察期內(nèi)動(dòng)物均無(wú)其他異?，F(xiàn)象。皮膚刺激強(qiáng)度平均分值為0，對(duì)照區(qū)無(wú)異?，F(xiàn)象。

2.2.4眼刺激試驗(yàn)結(jié)果

給藥后1 h，動(dòng)物受藥眼未見結(jié)膜充血、水腫，無(wú)分泌物，觀察至給藥后72 h，受藥眼未見異常。平均眼刺激積分指數(shù)（I.A.O.I）為0，眼刺激平均指數(shù)（M.I.O.I）48 h為5；對(duì)照眼無(wú)異常。

2.2.5皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗(yàn)

試驗(yàn)組所有動(dòng)物局部皮膚均未出現(xiàn)紅斑和水腫，動(dòng)物皮膚致敏率為0%，致敏強(qiáng)度為Ⅰ級(jí)。陽(yáng)性對(duì)照組（2-4-二硝基氯代苯）受試動(dòng)物皮膚涂藥區(qū)可見紅斑、水腫，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)皮膚潰爛，動(dòng)物皮膚致敏率為100%，致敏強(qiáng)度為Ⅴ級(jí)。陰性對(duì)照組動(dòng)物無(wú)異常反應(yīng)（表3）。

表3　膠原寡肽對(duì)豚鼠皮膚致敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3　Results of dermal allergy reaction of collagen oligoeptide on guinea pigs

3　結(jié)論

以河豚魚皮作為原料，先用酸堿進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行提取，再用兩步酶解法制備得到的河豚魚皮膠原寡肽分子量分布主要分布在100 u～1 000 u之間。雖然河豚魚中含有劇毒物質(zhì)河豚毒素[14]，但是河豚魚皮制備的膠原寡肽急性經(jīng)口、經(jīng)皮毒性均屬低毒，雌、雄性大鼠經(jīng)口LD50＞5 000 mg/kg，雌、雄性大鼠經(jīng)皮LD50＞2 000 mg/kg；對(duì)家兔皮膚、眼睛無(wú)刺激性，致敏強(qiáng)度為Ⅰ級(jí)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.044

收稿日期：2014-12-30

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014N0013）；福建省科技重大專項(xiàng)（2014NZ0001-2）

作者簡(jiǎn)介：郭洪輝（1982—），女（漢），助理研究員，博士，主要從事海洋生物資源綜合利用研究。

*通信作者

Toxicology and Safety Evaluation of Collagen Oligopeptide from Puffer Fish Skin

GUO Hong-hui1，WANG An2，HONG Zhuan1，*
（1.Engineering Research Center of Marine Biological Resource Comprehensive Utilization，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，F(xiàn)ujian，China；2.School of Public Health，Central South University，Changsha 410083，Hunan，China）

Abstract：Collagen oligopeptide from puffer fish skin was prepared by two-step enzymatic hydrolysis.The molecular weight of prepared collagen oligopeptide ranged from 100 u to 1000 u.According to the request of “procedures for toxicological assessment of food”and“Chemical irritation，allergic and haemolytic technology guidelines for research”，animal test was utilized for the safety evaluation of collagen oligopeptide from puffer fish skin.Acute oral toxicity test and acute dermal toxicity test indicated that its LD50on SD rats exceeded 5 000 mg/kg and 2 000 mg/kg，respectively.Skin，eye irritation tests were conducted on healthy white rabbits. The mean index of skin irritation and eye irritation（I.A.O.I）on rabbits were 0.The mean index of eye irritation after 48 h was 5.Guinea pigs were used in dermal allergy reaction.The intensity of sensitization wasⅠ.

Key words：puffer；collagen oligopeptide；acute toxicity test；toxicology；safety evaluation