藺會蘭　孫曉慧　劉俊霞　金立娟　田碩　張藝瑋　楊尊會　鐔麗霞

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

Bcl-2與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究

藺會蘭孫曉慧劉俊霞金立娟田碩張藝瑋楊尊會鐔麗霞

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

【摘要】目的比較卵巢功能減退患者和卵巢功能正常女性顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)情況，探討卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制。方法選擇接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的不孕患者48例，其中卵巢功能減退患者23例，卵巢功能正常對照患者25例。于取卵日收集卵泡液，離心收集顆粒細(xì)胞培養(yǎng)，用TUNEL檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況。免疫組化分析顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果卵巢功能減退組和卵巢功能正常組顆粒細(xì)胞凋亡率分別為(27 ±13) %、(18±8) %，卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞凋亡率較對照組增高(P<0.05) ;免疫組化分析顯示Bcl-2主要在顆粒細(xì)胞胞漿中表達(dá)，卵巢功能減退組Bcl-2蛋白表達(dá)較正常對照組下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論Bcl-2可能通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡情況，影響卵泡發(fā)育及卵巢的功能。

【關(guān)鍵詞】顆粒細(xì)胞;凋亡; Bcl-2;卵巢功能

項目來源:石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(編號: 131462553)

E-mail: linhl2011bs@163.com

近年來由于社會性、醫(yī)源性和自身因素的影響，卵巢功能減退發(fā)病率越來越高。尋找卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制對改善卵巢功能至關(guān)重要。卵泡由1個居于核心的卵母細(xì)胞及周圍的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞組成。在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞的增殖、分化對卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟起重要作用。顆粒細(xì)胞凋亡與卵子閉鎖及卵巢功能減退關(guān)系密切［1］。有學(xué)者認(rèn)為當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡達(dá)10%以上時該卵泡發(fā)生閉鎖，從而影響卵巢功能［2］。本研究通過比較卵巢功能減退患者和正常女性顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)情況，探討卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇我院2012年10月至2013年10月接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET/ICSI)治療的不孕患者48例。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡25～40歲，月經(jīng)周期25～35 d，B超檢查除外卵巢多囊改變、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥聲像改變，除外發(fā)熱及炎癥疾病，除外甲狀腺疾病、腎上腺疾病及其他系統(tǒng)腫瘤等?；颊吆炇鹬橥鈺?。根據(jù)基礎(chǔ)FSH值和卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)分為卵巢功能正常對照組(FSH＜8 U/L且竇卵泡數(shù)＞5 枚) 25例和卵巢功能減退組(FSH＞10 U/L或竇卵泡數(shù)＜5枚) 23例。

1.2控制性超促排卵方案卵巢功能正?；颊卟捎贸Ｒ?guī)長方案超促排卵。于前1個月經(jīng)周期B超監(jiān)測排卵，排卵后7 d(月經(jīng)第21～23天)開始每天皮下注射GnRH激動劑曲普瑞林(博福益普生制藥生產(chǎn)) 0.05～0.1 mg，14 d后根據(jù)患者的年齡、AFC及基礎(chǔ)血清FSH、LH、E2水平確定促性腺激素，采用重組人促卵泡素(商品名果納芬，默克雪蘭諾公司)和尿促性激素(HMG，麗珠制藥有限公司)劑量。陰道B超開始監(jiān)測卵泡大小，根據(jù)卵泡發(fā)育情況，調(diào)整用量劑量直至注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日止;卵巢功能減退患者采用短方案促排卵，在超促排卵前即月經(jīng)第2天B超下進(jìn)行竇卵泡計數(shù)、有無卵巢囊腫，給予GnRH激動劑曲普瑞林0.1 mg，1次/d，月經(jīng)的第3天給予促排卵藥物，陰道B超開始監(jiān)測卵泡大小，直至HCG日止當(dāng)1個主導(dǎo)卵泡平均直徑超過18 mm、2個主導(dǎo)卵泡平均直徑超過17 mm、3個主導(dǎo)卵泡平均直徑超過16 mm時給予人絨毛膜促性腺激素(HCG) 5 000或10 000 U肌內(nèi)注射，36 h后經(jīng)陰道超聲取卵。取卵后第3天超聲引導(dǎo)下行胚胎移植。

1.3顆粒細(xì)胞凋亡檢測取卵后，顯微鏡下小心剝離卵母細(xì)胞，剩余卵泡液收集于無菌試管中，2 500 r/mi離心10 min，棄上清，收集顆粒細(xì)胞用TUNEL方法進(jìn)行染色:將顆粒細(xì)胞涂片用10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定30 min后PBS沖洗，放入0.3%H2O2中1 h，加入0.1% TritonX-100，4℃反應(yīng)2 min，加入Tunel反應(yīng)混合物37℃濕盒中反應(yīng)1 h，加入DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并計數(shù)凋亡細(xì)胞百分比。凋亡陽性細(xì)胞在光鏡下呈棕黃色，正常細(xì)胞無著色。顯微鏡下任意選取視野，共計數(shù)500個細(xì)胞計算凋亡率(凋亡率=凋亡陽性的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.4免疫組化法檢測顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)吸取上層顆粒細(xì)胞放于PBS溶液中，1 000 r/min×10 min離心;棄上清，用1～2 ml的PBS重懸顆粒細(xì)胞，過300目細(xì)胞篩，即獲取顆粒細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，取顆粒細(xì)胞的單細(xì)胞懸液1 ml，用6 ml含有10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，PBS漂洗兩遍后，1% Triton-100室溫孵育30 min破膜; PBS漂洗3遍后，滴加3% H2O2。室溫孵育30 min; PBS漂洗3遍后，滴加封閉液，室溫孵育20 min;移除封閉液后，滴加Ⅰ抗(1∶100) 4℃過夜; PBS漂洗3遍后滴加Ⅱ抗37℃25 min; PBS漂洗3遍后滴加SABC20，37℃20 min，再用PBS漂洗DAB顯色;最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，用1%鹽酸酒精分化，用1%氨水返藍(lán)，再經(jīng)過乙醇梯度脫水、松節(jié)油透明后即可封片、鏡下觀察和采集圖像。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12組臨床資料比較卵巢功能減退組和卵巢功能正常組患者年齡、促黃體生成素(LH)、睪酮比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05) ;卵巢功能減退組和卵巢功能正常組患者FSH、E2、竇卵泡數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　2組臨床資料比較　±s

表1　2組臨床資料比較　±s

注:與卵巢功能正常組比較，*P＜0.05

指標(biāo)　卵巢功能減退組(n=23)　卵巢功能正常組(n=25)年齡(歲)33.24±4.62　30.82±4.12體重指數(shù)(kg/m2)　21.54±9.72　20.68±9.35不孕年限(年)　4.21±2.17　3.83±1.76 FSH(U/L)　11.48±1.06*　6.28±0.92 LH(U/L)　5.44±1.94　4.55±1.03 E2(pmol/ml)　215.49±57.38*　189.75±71.06 T(pmol/ml)　1.07±0.66　1.18±0.58竇卵泡數(shù)(枚)　6.53±1.88*14.34±3.29

2.22組顆粒細(xì)胞凋亡率比較卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞凋亡率為(27±13) %高于卵巢功能正常組的(18±8) %，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TUNEL染色卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色，正常組無著色。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測bcl-2蛋白的表達(dá)卵巢功能減退患者顆粒細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。顆粒細(xì)胞著色深度低于正常對照組。見圖1。

3　討論

圖1　免疫細(xì)胞化學(xué)檢測bcl-2蛋白表達(dá)(DAB顯色×400)

卵巢功能減退是婦科常見疾病之一，近年發(fā)病率呈上升趨勢。引起卵巢功能減退的原因可能有遺傳性、免疫性、醫(yī)源性、代謝性因素，環(huán)境污染、毒物接觸及吸煙、抑郁和未產(chǎn)婦長期月經(jīng)紊亂等，其臨床表現(xiàn)主要以閉經(jīng)、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高為特征，常伴有圍絕經(jīng)期綜合征的癥狀，如潮熱、多汗、情緒不穩(wěn)定、性欲低下、陰道干澀等。處于生育期的女性提早閉經(jīng)，在心理上會產(chǎn)生沉重包袱，影響婚姻生活質(zhì)量，產(chǎn)生一系列心理和社會問題。卵巢功能減退的治療方法包括:卵巢組織冷凍、激素替代、中醫(yī)中藥等［3］。

卵巢中卵泡發(fā)育由始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡到成熟卵泡，其中99%的卵泡在不同階段閉鎖。對發(fā)育卵泡而言，細(xì)胞凋亡的最終表現(xiàn)為卵泡閉鎖，其中顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要直接原因。卵巢功能減退的主要原因就是卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加，卵泡閉鎖加速，卵母細(xì)胞的凋亡［4］。顆粒細(xì)胞是卵泡表面包裹的一層壁細(xì)胞，其與卵母細(xì)胞間存在復(fù)雜的連接機(jī)制，在卵丘周圍形成一個多層次的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，與卵泡進(jìn)行物質(zhì)交換及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)。顆粒細(xì)胞一方面運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)給卵母細(xì)胞，另一方面與卵泡內(nèi)膜細(xì)胞共同作用分泌激素、生長因子等多種物質(zhì)，影響卵母細(xì)胞發(fā)育，影響卵巢功能［5］。此外，顆粒細(xì)胞貯存并釋放的某些生長因子和特定蛋白質(zhì)在卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育過程中按一定順序表達(dá)并選擇性地彌散來發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的作用［6］。在卵泡周期性發(fā)育過程中，各個時期卵泡的閉鎖與顆粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［7］。顆粒細(xì)胞凋亡增加可能影響卵母細(xì)胞的成熟，進(jìn)一步影響受精和胚胎的發(fā)育潛能［8］。有研究［9］表明顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞核的成熟、受精有關(guān)。也有研究表明顆粒細(xì)胞凋亡增加可能會引起卵母細(xì)胞核成熟延遲，導(dǎo)致受精能力下降［10，11］。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡是處在一個非常復(fù)雜內(nèi)環(huán)境控制下完成的，并具有高度協(xié)調(diào)性，它不僅有下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)作用，也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的調(diào)控機(jī)制，也存在其他組織產(chǎn)生的影響細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的作用［12］。顆粒細(xì)胞凋亡受卵泡刺激素、黃體生成素、雌孕激素、生長因子及受體和細(xì)胞活素等因素影響。線粒體DNA缺失可能會使卵泡細(xì)胞凋亡加速而引起卵巢早衰［13］lee等［14］將鼠線粒體與卵巢顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，線粒體具有防止顆粒細(xì)胞凋亡的作用，但具體機(jī)制尚不十分清楚。本研究中卵巢功能減退患者顆粒細(xì)胞凋亡率明顯高于卵巢功能正常者。

參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要基因有多種，其中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)家族對凋亡起決定作用的。Bcl-2家族位于胞質(zhì)面的線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，已知的家族成員至少有15個，抑制凋亡發(fā)生的主要成員包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等。Bcl-2基因是一種細(xì)胞凋亡信號基因，其家族成員是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素。Bcl-2蛋白可存在于免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等正常組織中，亦存在于人卵巢組織中。有研究發(fā)現(xiàn)對鼠類卵巢顆粒細(xì)胞凋亡起決定性作用［15］。對只在卵細(xì)胞表達(dá)Bcl-2而在體細(xì)胞中無表達(dá)的小鼠研究發(fā)現(xiàn)卵細(xì)胞凋亡受抑制，這些小鼠竇前卵泡的閉鎖明顯少于野生型小鼠，說明Bcl-2有保護(hù)竇前卵泡的作用，其作用機(jī)制可能是抑制卵細(xì)胞凋亡［16］。研究表明Bcl-2不僅可以通過直接抑制卵細(xì)胞凋亡或促進(jìn)始基卵泡數(shù)量增多等途徑發(fā)揮其對卵泡的發(fā)育調(diào)節(jié)作用，其抗凋亡作用還可能通過卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞發(fā)揮作用。卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡通過線粒體途徑介導(dǎo)bax表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放出來，繼而激活Caspase-3、Caspase-9，引發(fā)Caspases級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡［17］。而Bcl-2通過抗氧化途徑起到抑制凋亡的作用［18］。有研究表明Bcl-2可以防止線粒體內(nèi)Ca2+與細(xì)胞色素C向外釋放，降低細(xì)胞代謝過程的活性氧，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡［19］。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞中特異表達(dá)Bcl-2的轉(zhuǎn)基因鼠，排卵數(shù)明顯高于對照組［20，21］。Bcl-2過表達(dá)可拮抗bax，抑制卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其分泌雌、孕激素，進(jìn)而控制卵母細(xì)胞凋亡，延緩卵泡閉鎖，改善圍絕經(jīng)期綜合征［22，23］。動物實驗表明，當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖時，在顆粒細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測不到凋亡抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物Bcl-2蛋白［24］。另外Bcl-2亦可防止一些與凋亡有關(guān)的基因被激活并抑制這些基因表達(dá)產(chǎn)物的功能。本研究利用免疫組化技術(shù)檢測顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白主要在細(xì)胞漿著色，呈棕黃色。在卵巢功能減退患者的顆粒細(xì)胞中，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)以及著色深度顯著低于正常卵巢的顆粒細(xì)胞。推測Bcl-2可能參與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過程，間接影響卵母細(xì)胞的凋亡，在卵巢早衰的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。盡管Bcl-2調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不十分清楚，但通過對Bcl-2基因的研究，并將其導(dǎo)入卵巢組織中，將會成為是治療卵巢功能減退的一種新方法，也可為臨床診斷確定分子靶點(diǎn)的研究提供參考依據(jù)。

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(收稿日期:2014－10－11

通訊作者:孫曉慧，050011河北省石家莊市第一醫(yī)院;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.010

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1316－04

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R 7111.75