王振龍,鄧 騫,王子明

(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

·基礎研究·

誘導/封閉自噬相關基因7對腎癌786-0細胞自噬的調控作用研究

王振龍,鄧 騫,王子明

(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

目的 探討誘導/封閉Atg7對腎癌786-0細胞自噬的調控作用。方法 構建上調Atg7的慢病毒載體plenti6.3-Atg7，下調Atg7的慢病毒載體sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv，空載對照慢病毒載體sh-scramb-con lv、plenti6.3-GFP，分別轉染腎癌786-0細胞系，未轉染的786-0細胞系為空白對照。RT-PCR和Western blot檢測各組Atg7的表達,研究plenti6.3-Atg7激活Atg7效率和sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv抑制Atg7效率。 Western blot檢測上述各組細胞LCII/LC3I蛋白比值，研究上調及下調Atg7對腎癌786-0細胞自噬的激活及抑制作用。結果 經過篩選，成功構建穩(wěn)定上調Atg7的786-0/plenti6.3-Atg7xbx細胞系、穩(wěn)定下調Atg7的786-0/sh-Atg-2 lv細胞系、空載對照786-0/sh-scramb-con lv、786-0/plenti6.3-GFP細胞系。與空白對照組比較，Atg7上調組786-0細胞LCII/LC3I比值顯著升高(3.31±0.12vs. 2.23±0.10P<0.01)，具有穩(wěn)定的自噬激活作用；Atg7下調組的786-0細胞LCII/LC3I比值顯著降低(1.45±0.11vs. 2.23±0.10P<0.01)，具有穩(wěn)定自噬抑制作用。結論 上調Atg7對腎癌786-0細胞系具有自噬激活作用，下調Atg7對腎癌786-0細胞系具有自噬抑制作用。

自噬；腎透明細胞癌；自噬相關基因7；sh-Atg7；plenti6.3-Atg7.

腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，其發(fā)病率約以每年2%的速度增長,特別是晚期腎癌病例明顯增加[1]。腎癌中凋亡處于受損和低表達狀態(tài)，抗凋亡機制是腎癌細胞增殖進展，并對諸多治療不敏感的原因之一[2]。自噬作為不同于凋亡的細胞程序性死亡方式，在抑制腫瘤細胞增殖中發(fā)揮重要調節(jié)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)腎癌多種細胞系及腎癌組織中自噬呈受抑制狀態(tài)，腎癌組織中自噬水平與腫瘤分期、分級負相關。提示自噬在腎癌中起誘導細胞死亡的作用[3]。通過調控自噬能否影響腎癌細胞增殖以及腎癌自噬的調控方法，目前文獻報道不多。本研究通過調控自噬相關基因(autophagy-related genes7, Atg7),探討以Atg7作為靶點調控腎癌786-0細胞自噬的作用及由此建立自噬激活/抑制腎癌786-0細胞系模型的可行性，為后續(xù)進行腎癌自噬作用及機制研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 實驗材料本實驗選用研究人員普遍采用的腎癌786-0細胞系作為研究對象，細胞系購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。兔抗人ATG7多克隆抗體，兔抗人Beclin1多克隆抗體購于英國abcam生物公司，兔抗人LC3多克隆抗體購于美國Sigma生物公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體，HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG購于北京TransGen生物公司，Western-blot Lumious發(fā)光試劑購于美國Millipore公司，N-N’亞甲雙丙烯酰胺購于北京索萊寶生物公司，蛋白Maker購于北京TransGen生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Atg7高表達慢病毒的構建 ①Atg7全基因合成。根據Genebank提供的人Atg7基因全長序列分析檢查基因內部是否含有復雜二級結構和重復序列。根據序列分析結果，進行單鏈oligo合成。利用PCR對合成的oligo進行拼接反應。將拼接的PCR產物TA克隆到T載體中，將載體轉入宿主菌中。測序驗證，如有突變，進行突變修復后，再次驗證直到序列正確無誤。②設計和構建Atg7高表達慢病毒。將目的基因構建入plenti6.3-MCS-IRES-GFP載體上，測序驗證。將包裝細胞培養(yǎng)至對數(shù)期。進行Atg7高表達慢病毒包裝，獲得病毒粗液。微孔過濾清除雜質，高速離心濃縮病毒，并測定滴度。將未重組的空載體慢病毒包裝。以上過程均由上海諾百生物有限公司完成。

1.2.2 Atg7低表達慢病毒及空載體慢病毒的建立 ①sh-Atg7的設計和合成 根據生物信息學的方法篩選得到2條干擾序列sh-Atg7-1及sh-Atg7-2，其作用于Atg7的位點見表1。根據設計結果合成shRNA。將片段插入構建重組質粒。②Atg7低表達慢病毒的構建將重組質粒酶切，將啟動子連同插入片段一起轉克隆至工作質粒。測序驗證。Atg7低表達慢病毒及將未重組的空載體慢病毒包裝。以上過程均由西安博達生物有限公司完成。

表1 RNA干擾序列的靶向作用位點

名稱序列Atg7上的靶位sh-Atg7-15'-CCGGGGGCCAGTGGGTTTGGATCAACTCGAGTTGATCCAAACCCACTGGCCCTTTTTG靶向609～627位點sh-Atg7-25'-CCGGAAGGAGTCACAGCTCTTCCTTCTCGAGAAGGAAGAGCTGTGACTCCTTTTTTTG靶向691～709位點

1.2.3 Puromycin最低耐受實驗 進行腎癌細胞786-0的Puromycin最低耐受實驗，及ATG7慢病毒轉染穩(wěn)定抗性克隆的篩選。

1.2.4 RP-CR法檢測ATG7基因的表達 將各種穩(wěn)定轉染細胞以5×105個/瓶的密度種植于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞生長融合至90%左右時，棄去培養(yǎng)液，PBS反復沖洗后，使用Trizol提取各種細胞總mRNA。使用廣譜分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳對RNA純度進行鑒定。結果進一步證明我們提取的mRNA符合實驗對RNA純度的要求。

進行逆轉錄反應(cDNA合成)，使用TransGen公司TranscriptTM逆轉錄試劑盒進行反轉錄，建立反轉錄反應體系，按照說明書步驟進行操作。引物設計及合成如下：Forward，LC3 5′-GAGCAGCATCCAACCAAA-3′；Revers，5′- CGTCTCCTGGAGGCATA-3′。進行聚合酶鏈反應，反應結束后，確認β-actin和各組目的基因的擴增曲線和融合曲線，檢查擴增的特異性，并求出各個基因的標準曲線。用IQTM5多重實時定量PCR儀中自帶的結果分析軟件求得各樣本的CT值，按照文獻報道的方法，以2-△△CT法計算各實驗組基因表達與對照組比較的比值。

1.2.5 Western blot法檢測Atg7的表達 將各種生長狀態(tài)良好的細胞以5×105個/瓶的密度種植于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞生長融合至90%左右時，棄去培養(yǎng)液，PBS反復沖洗后，使用RIPA裂解液提取各種細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。將上述得到的蛋白提取液，加入適量上樣緩沖液后，與沸水中煮8 min，使蛋白得以變性。-20℃冰箱內保存。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，檢測目的蛋白。一抗為：Atg7(1∶10 000)、β-actin(1∶10 000)。在凝膠成像系統(tǒng)中照相，以圖片形式保存。蛋白免疫圖像結果分析。使用Quanlity One圖像分析系統(tǒng)對獲得的圖像進行灰度分析。將統(tǒng)一樣品的目的蛋白灰度值和相應的內參灰度值相比，得到蛋白相對表達量，實驗結果取3次試驗的平均值。

1.2.6 Western blot法檢測LC3基因的表達 方法同上，轉膜時間為30 min，一抗?jié)舛葹?∶800。

1.3 統(tǒng)計學處理使用SPSS 17.0軟件對相關實驗數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，組間比較使用ANOVA單因素方差分析，P<0.05表示為具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 Atg7慢病毒轉染786-0細胞系結果構建上調Atg7的慢病毒載體plenti6.3-Atg7及空載對照plenti6.3-GFP，下調Atg7的慢病毒載體sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv及空載對照sh-scramb-con lv，分別轉染786-0細胞系，未轉染786-0細胞為空白對照組。(圖1)所示，與空載對照組相比，在mRNA水平上，plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv顯著上調和下調Atg7mRNA的表達(P<0.05)，而sh-Atg7-1 lv的下調作用與空載對照組無差異。在蛋白水平上，plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv顯著上調和下調Atg7蛋白的表達(P<0.05)，而sh-Atg7-1 lv的下調作用與空載對照組無差異。證實我們成功構建了穩(wěn)定上調Atg7的786-0/plenti6.3-Atg7細胞系和穩(wěn)定下調Atg7的786-0/sh-Atg-2 lv細胞系。

圖1 慢病毒轉染轉染后Atg7的mRNA表達水平

與plenti6.3-GFP陰性對照相比，plenti6.3-Atg7轉染細胞Atg7表達水平升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與sh-scramb-con lv陰性對照相比，sh-Atg-2 lv轉染細胞Atg7表達水平下降，差異具有顯著性(P<0.05)，而sh-Atg-1 lv轉染細胞則無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 調控Atg7基因表達對786-0細胞自噬的影響調控Atg7基因表達對786-0細胞自噬的影響見圖2。在蛋白水平上，與空白對照組相比，Atg7上調組786-0細胞LCII/LC3I比值顯著升高(3.31±0.12vs.2.23±0.10，P<0.01)，具有自噬激活作用；Atg7下調組的786-0細胞LCII/LC3I比值顯著降低(1.45±0.11vs.2.23±0.10，P<0.01)，具有自噬抑制作用。通過上調和下調Atg7成功構建了自噬激活及自噬抑制的786-0腎癌細胞系。

與786-0細胞和plenti6.3-GFP陰性對照相比，plenti6.3-Atg7轉染細胞Atg7和LC3II蛋白表達水平升高，差異具有顯著性(P<0.01)；與786-0細胞和sh-scramb-con lv陰性對照相比，sh-Atg-2 lv轉染細胞Atg7和LC3II蛋白表達水平升高，差異具有顯著性(P<0.01)。

圖2 慢病毒轉染后Atg7和LC3蛋白表達水平

3 討 論

細胞自噬是真核細胞在不利的外源刺激下通過雙層膜包裹自身受損的細胞器和大分子物質形成自噬體，并降解其內容物, 實現(xiàn)細胞的代謝需要細胞器的更新。自噬一方面為細胞提供能量再循環(huán)，避免凋亡和壞死。另一方面過度自噬導致細胞必需成分過度清除，引起細胞發(fā)生不同于凋亡的另一種細胞程序性死亡——自噬性死亡[4]。自噬與多種疾病特別是腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關[5]。通過調控細胞自噬，影響腫瘤增殖、侵襲目前已有部分研究。某些腫瘤中通過抑制自噬抑制腫瘤增殖，他莫昔芬可抑制乳腺癌MCF-7自噬，降低了細胞對不利外源刺激的保護作用，表現(xiàn)為凋亡增加，抑制腫瘤增殖進展，同時也具有放療增敏作用[6]。某些腫瘤中促進自噬抑制腫瘤增殖。微管相關化療藥物(長春新堿、紫杉醇等)可誘導胃癌轉移灶細胞自噬性死亡。多西紫杉醇可誘導細胞自噬進而促進凋亡，抑制宮頸癌HeLa細胞增殖侵襲。腎癌多種細胞系及腎癌組織中自噬呈受抑制狀態(tài)，且自噬水平與腫瘤分期、分級負相關。提示自噬在腎癌中起誘導細胞死亡的作用[3]。自噬是否在腎癌發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用,自噬與凋亡的關系，自噬在誘導腎癌細胞死亡中是否占主導地位，調控腎癌細胞自噬對腎癌增殖能力的影響及機制，上述問題尚缺少相關研究文獻，需要進一步研究。選擇一種有效、特異的調控腎癌細胞自噬的靶點及方法是上述研究首要解決的問題，也是本研究的目的。

自噬調控靶點的選擇關系到調控效果，目前沒有“金方法”。調控自噬的方式有外源性調控和內源性調控兩種。外源性自噬調控藥物如自噬誘導劑如雷帕霉素(rapamycin)，能夠抑制mTOR，促進自噬。自噬抑制劑如氯喹和輕氯喹，能阻斷自噬體和溶酶體融合過程，抑制自噬體成熟及降解。外源性的調控劑均非特異性地激活或抑制自噬，往往伴隨細胞其他功能的改變，因此，不適合用于對腎癌自噬作用的研究。自噬的內源性調控以自噬信號通路的調節(jié)為主要方式，如：雷帕霉素的靶位TOR(target of rapamycin)、PI3K (phosphoinositide-3 kinase)、鈣、激素、氨基酸。Beclin1、LC3(mierotubule-associated protein lightchain3)、Atg7等自噬體形成過程中的關鍵因子是目前自噬研究中常選擇的調控靶點。調控它們的表達水平就可能實現(xiàn)對自噬活性的調控。但Beclin1在常態(tài)下與抗凋亡蛋白Bcl-2相結合[7]，調控Beclin1的表達水平可能直接影響細胞的凋亡。TIAN等[8]發(fā)現(xiàn)有非Beclin1依賴性的自噬通路，并且與細胞死亡聯(lián)系緊密，因此調控Beclin1不是最佳調控靶點。KUMA等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過轉染并過表達LC3，LC3有聚集的趨勢，反而不參與自噬體的形成，也不符合研究要求。

Atg7在自噬小體膜的形成和延伸過程中參與了兩種共扼結合系統(tǒng)。第一種共扼活動里,Atg7和Atg3作為E1和E2兩種生物酶同系物分別參與泛素化的過程，首先Atg8/LC3被半朧氨酸蛋白酶Atg4分解，分解后得到激活了的LC3-I，隨后LC3被Atg7所激活,進一步轉運到Atg3。Atg3與Atg8/LC3一起共扼結合到磷脂酞乙醇胺上形成LC3-II,它是一種脂質結合體,與自噬小體膜的形成有關[10]。另一個自噬反應的共扼活動里,Atg7和Atg10分別作為El和EZ生物酶同系物[11]，Atg7水解ATP并通激活Atg12，具有活性的Atg12通過Atg10轉移到Atgs上，Atgs/ag12復合物通過非共價鍵結合Atg16寡聚體化后形成一個大分子復合物,這種復合體在Atgs/LC3參與的自噬小體膜形成和延伸過程中起重要作用。Atg7同時參與了Beclin1和LC3的活化，因此，Atg7可能是一種調控自噬的有效靶點。多項研究以Atg7作為自噬調控靶點，獲得滿意結果[13-14]。而調控Atg7對腎癌細胞自噬的作用，鮮有文獻報道，因此調控Atg7對腎癌細胞自噬的作用我們進行了進一步研究。

我們前期選取了目前腎癌研究中最常使用的具有代表性的4種腎癌細胞株ACHN、OS-RC-2、769-P、786-0同正常腎小管上皮細胞HK-2比較上述腎癌細胞系自噬水平，研究發(fā)現(xiàn)786-0細胞系中自噬相關基因Atg7、Beclin1 mRNA 和蛋白表達水平相較其他腎癌細胞系表達最低，自噬抑制最明顯，具有較好的典型性[3]，因此，我們選擇786-0細胞系作為我們研究的細胞系。

慢病毒載體plenti6.3-Atg7及sh-Atg-1 lv轉染腎癌786-0細胞否具有上調/下調細胞Atg7表達的作用，本課題進行了以下研究。本研究構建了自噬相關基因的Atg7的慢病毒載體plenti6.3-GFP、plenti6.3-Atg7、sh-scramb-con lv、sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv及空載對照細胞plenti6.3-GFP、sh-scramb-con lv分別轉染腎癌786-0細胞。慢病毒plenti6.3-Atg7轉染786-0細胞與plenti6.3-GFP空載對照相比，plenti6.3-Atg7轉染的細胞Atg7表達水平升高，差異具有顯著性(P<0.05)。sh-Atg-1 lv、sh-Atg-2 lv分別轉染786-0細胞與sh-scramb-con lv空載對照組相比，sh-Atg-2 lv轉染細胞Atg7表達水平下降，差異具有顯著性(P<0.05)，而sh-Atg-1 lv轉染細胞則無顯著性差異(P>0.05)。說明慢病毒plenti6.3-Atg7轉染786-0細胞后可以穩(wěn)定上調細胞Atg7的表達，sh-Atg-2 lv轉染786-0細胞可以穩(wěn)定下調細胞Atg7的表達。慢病毒plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv轉染效率和表達效率均較高，說明通過慢病毒轉染及構建si-RNA基因敲除方式具有上調/下調腎癌786-0細胞系Atg7表達的作用。

調控Atg7對細胞自噬的作用目前已有部分研究，PATTISON等[12]將Atg7作為自噬調控點，通過上調和下調Atg7的方法到可以達到調節(jié)自噬活性的目的，MORTENSEN等[13]也獲得了類似的效果。而調控Atg7對腎癌自噬的作用鮮有報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，與786-0細胞空白對照組和plenti6.3-GFP空載對照相比，plenti6.3-Atg7轉染細胞LCII/LC3I比值顯著升高(P<0.01)，sh-Atg-2 lv轉染細胞LCII/LC3I比值顯著降低(P<0.01)，說明上調Atg7基因后，細胞自噬水平升高，下調Atg7基因后，細胞自噬水平被抑制。以上結果提示，plenti6.3-Atg7和sh-Atg-2 lv可以有效的抑制和激活腎癌786-0細胞的自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)調控自噬相關基因Atg-7是有效地調節(jié)腎癌786-0細胞自噬水平的方法。并成功構建了自噬激活/抑制腎癌786-0細胞系，為后續(xù)進行腎癌自噬作用及機制研究奠定基礎。

[1] ANTONIO R, VIVAR C, MICHAEL E, et al. The biology of interleukin-2 efficacy in the treatment of patients with renal cell carcinoma[J]. Med Oncol,2009,26:13-19.

[2] SCHELTEMA JM, ROMIJN JC, VAN STEENBRUGGE GJ, et al. Inhibition of apoptotic proteins causes multidrug resistance in renal carcinoma cells [J]. Anticancer Res, 2001, 21(5):3161-3166.

[3] DENG Q, WANG ZL, WANG L, et al. LowermRNA and protein expression levels of LC3 and Beclin1, markers of autophagy, were correlatedwith progression of Renal Clear Cell Carcinoma [J]. Jpn J Clin Oncol,2013,43(12):1261-1268.

[4] ALTMAN BJ, RATHMELL JC. Metabolic stress in autophagy and cell death pathways[J]. Cold spr harb persp biol,2012,4(9):a008763.

[5] CUERVO AM,CELL BIOLOGY. Autophagy’s top chef[J]. Science,2011, 332(6036): 1392-1393.

[6] PEL A, HERR I, SCHWARZ H, et al. Blocked autophagy sensitizes resistant carcinoma cells to radiation therapy[J]. Cancer Res 2008;68(5):1485-1494.

[7] JACOB M GUMP, ANDREW THORBURN. Autophagy and apoptosis: what is the connection? [J]. Trend Cell Biol, 2011, 21(7):387-392.

[8] TIAN SH, LIN JA, ZHOU J, et al. Beclin 1-independent autophagy induced by a Bcl-X(L)/Bcl-2 targeting compound, Z18 [J]. Autophagy, 2010, 6(8):1032-1041.

[9] KUMA A, MATSUI M, MIZUSHIMA N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy [J]. Autophagy, 2007, 3(4):323-328.

[10] VON MUHLINEN N, AKUTSU M, RAVENHILL BJ, et al. An essential role for the ATG8 ortholog LC3C in antibacterial autophagy[J]. Autophagy, 2013, 9 (5). 784-786.

[11] SHPILKA T, WEIDBERG H, PIETROKOVSKI S, et al. Atg8: an autophagy-related ubiquitin-like protein family[J]. Genome Biol, 2011, 12 (7): 226.

[12] PATTISON JS, OSINSKA H, ROBBINS J. Atg7 induces basal autophagy and rescues autophagic deficiency in CryAB(R120G) cardiomyocytes [J]. Circul Rese, 2011, 109(2):151-160.

[13] MORTENSEN M, WATSON AS, SIMON AK. Lack of autophagy in the hematopoietic system leads to loss of hematopoietic stem cell function and dysregulated myeloid proliferation [J]. Autophagy, 2011, 7(9):1069-1070.

(編輯 王 瑋)

Effect of overexpression/knockdown Atg7 on the autophagy of 786-0 renal clear carcinoma cell lines

WANG Zhen-long, DENG Qian, WANG Zi-ming

(Department of Urology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To explore the regulative effect of autophagy-related gene Atg7 on the autophagy of 786-0 cell line in renal cell carcinoma (RCC). Methods Atg7-overexpression plasmid plenti6.3-Atg7 and Atg7 specific microRNA- expressing plasmid sh-Atg-2 lv were established and identified. Plenti6.3-Atg7 and sh-Atg-2 lv were transfected into 786-0 cells, Western blot was used to detect LCII/LC3I respectively. Results 786-0 cells with Atg7-overexpression and Atg7-knockdown were obtained. Cells with Atg7-overexpression showed increased LC3II/LC3I compared with controls(3.31±0.12vs. 2.23±0.10,P<0.01), while cells with Atg7-knockdown showed reduced LC3II/LC3I compared with controls(1.45±0.11vs. 2.23±0.10,P<0.01). Conclusions 786-0 cells with Atg7-overexpression promote autophagy while 786-0 cells with Atg7-knockdown inhibit autophagy.

autophagy; renal clear cell carcinoma; Atg7; sh-Atg7; plenti6.3-Atg7

2014-09-11

2015-01-22

王子明,主任醫(yī)師,教授.E-mial: ziming-w@263.net

王振龍(1979-),男(漢族),博士,副主任醫(yī)師.研究方向:泌尿系腫瘤及腔內微創(chuàng)技術.E-mial:zhenlongw2001@163.com

R737.11

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-04-016