劉青松 李 瑜 李珍珍 劉莉娜 王葉菁,2 何華偉,2,3,*

(1.西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，2.生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716;3.中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點實驗室，北京 100101)

家蠶絲素重鏈C末端序列分析、克隆及表達(dá)純化

劉青松1,2，#李 瑜1,2，#李珍珍1,3劉莉娜1王葉菁1,2何華偉1,2,3,*

(1.西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，2.生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716;3.中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點實驗室，北京 100101)

蠶絲主要由絲素和絲膠蛋白組成，其中絲素包括絲素重鏈，絲素輕鏈和P25蛋白。絲素重鏈蛋白分子量大，體外表達(dá)困難，難以分離純化，很難對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。本文通過對絲素重鏈基因的分析，以家蠶5齡3d后部絲腺cDNA為模板，克隆獲得了絲素重鏈C末端堿基序列，并將其構(gòu)建到pET-50b(+)表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過鎳柱親和層析純化獲得了絲素重鏈C末端的融合蛋白，為進(jìn)一步研究蠶絲蛋白的折疊和組裝奠定了研究基礎(chǔ)。

家蠶；絲素重鏈；C末端；克?。槐磉_(dá)純化

家蠶絲是當(dāng)今最引人矚目的生物材料之一。蠶絲纖維的性能(如纖度、強(qiáng)度、彈性、導(dǎo)熱性和吸濕性)與其理化性質(zhì)密不可分，蠶絲纖維的理化性能與蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，但關(guān)于蠶絲蛋白結(jié)構(gòu)與其纖維性能之間關(guān)系的研究卻很少，這主要是由蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)特點所決定。蠶絲蛋白主要由絲素(Fibroin)和絲膠組成，其中絲素占蠶絲蛋白總重的75%，它構(gòu)成了蠶絲纖維的主要結(jié)構(gòu)成分。絲素蛋白由絲素重鏈(Fibroin heavy chain，F(xiàn)ib-H)、絲素輕鏈(Fibroin light chain，F(xiàn)ib-L)和P25蛋白組成，其中Fib-H是絲素蛋白的主要結(jié)構(gòu)組份[1-2]。絲素重鏈?zhǔn)且环N纖維狀蛋白，由N末端結(jié)構(gòu)域、C末端結(jié)構(gòu)域和中間大量的重復(fù)區(qū)域-非重復(fù)區(qū)域交錯排列狀結(jié)構(gòu)組成，它決定了蠶絲纖維的物理和化學(xué)性能[3-4]。從天然的繭絲中分離純化絲素重鏈蛋白相當(dāng)困難，因此越來越多的研究者都致力于尋找一種能大量獲取絲素重鏈蛋白的途徑和方法，從而研究蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系。

周叢照等[5-6]利用X-射線晶體衍射技術(shù)成功解析了Fib-H N末端(Fib-H NT)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，推測在蠶絲纖維的形成過程中，F(xiàn)ib-H NT可能具有兩種功能：一是形成納米球狀結(jié)構(gòu)，包裹絲素重鏈中的疏水重復(fù)區(qū)并增加整個蛋白的溶解性；二是Fib-H NT可以首先感知外界環(huán)境因素的改變，作為一種折疊啟動子啟動整個絲素重鏈蛋白的折疊，最終Fib-H NT以β折疊片的形式成為蠶絲纖維結(jié)構(gòu)的一部分。He等[6]體外表達(dá)純化了家蠶Fib-H N末端結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)pH對絲素蛋白自組裝行為具有重要影響。當(dāng)pH值為6.0左右時，F(xiàn)ib-H NT由無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH=4.7時，F(xiàn)ib-H NT呈雙層反向平行β-折疊結(jié)構(gòu)，每層由兩個Fib-H NT分子相互作用。

絲素重鏈N末端對絲素蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變具有重要的作用，但是C末端在蠶絲纖維形成的過程中發(fā)揮什么樣的功能當(dāng)前仍不清楚。本文分析了Fib-HC末端序列的氨基酸組成和性質(zhì)，預(yù)測了其二級結(jié)構(gòu)。以后部絲腺cDNA為模板，克隆了Fib-HC末端堿基序列，并將其構(gòu)建到pET-50b(+)表達(dá)載體，通過大腸桿菌成功實現(xiàn)了Fib-HC末端融合蛋白的表達(dá)，為深入研究Fib-H C末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能奠定了很好的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

克隆用的菌株為Escherichiacoli(E.coli)DH5α，表達(dá)用的細(xì)胞為E.coliBL21(DE3)，表達(dá)質(zhì)粒pET-50b(+)，均為本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶和DNA Marker購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自上海華舜公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；氨芐青霉素(Amp)、硫酸卡納霉素(Kana)均為上海生工提供。

1.2 Fib-HC堿基序列的克隆

取家蠶五齡三天后部絲腺，參照 TrizolRNA提取試劑盒的使用說明提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在NCBI上下載家蠶Fib-H基因的編碼序列，利用primer premier 5.0軟件根據(jù)Fib-H基因進(jìn)行引物設(shè)計，加入BamHI和HindIII的酶切位點，分別以下劃線指示。上游引物：5’-CGCGGATCCGTCAGTTACGGAGCTGGCAG-3’，下游引物：5’-CCCAAGCTTTTAGCAATTCACACAAGGCAG-3’，以后部絲腺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：cDNA模板2μL，10 × reaction buffer 2.5μL，2.5mM MgCl22μL，2.5mM dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶 0.5μL，上下游引物各0.5μL，加去離子水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，然后94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。

1.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測序驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌株，挑取單克隆37℃培養(yǎng)過夜，然后接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6，加入IPTG至終濃度為0.2mM，于16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h。離心收集菌體，重懸后超聲破碎，并用15%的SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)。

1.4 融合蛋白的分離純化和檢測

將大量誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)液離心收集菌體，加入緩沖液懸浮，超聲破碎釋放融合蛋白，通過鎳柱親和層析對裂解液中的融合蛋白進(jìn)行分離提純。利用組氨酸標(biāo)簽抗體，進(jìn)行Westernblotting鑒定目的蛋白的表達(dá)。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點和疏水性，利用SignalP 4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別預(yù)測信號肽和跨膜螺旋，利用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 Fib-HC序列生物信息學(xué)分析

2.1.1 Fib-HC末端結(jié)構(gòu)域的理化性質(zhì)

Fib-HC編碼的氨基酸序列總長為58個氨基酸，包含15種氨基酸(圖1-A)，其中絲氨酸含量最高(17.2%)，其次為精氨酸(13.8%)、甘氨酸(12.1%)和丙氨酸(10.3%)。天冬氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的含量最低，僅為1.7%。絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量相當(dāng)高(36.2%)，這與絲素重鏈中這些氨基酸的含量趨勢基本一致。該蛋白質(zhì)的理論等電點為10.59，這與精氨酸的含量高達(dá)13.8%，而其他酸性氨基酸含量較低密切相關(guān)。該蛋白的分子質(zhì)量為6171.9Da。

圖1 氨基酸組成分布(A)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(B)

2.1.2 Fib-HC末端的二級結(jié)構(gòu)分析

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示Fib-H C末端兩端都是由無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成，中間包含有一段短的α-螺旋、一段α-螺旋和一段短 β-折疊片段組成(圖1-B)，其中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量占65.5%，這與新生的絲素重鏈蛋白總體的結(jié)構(gòu)趨勢基本一致。

2.1.3 Fib-H C疏水性和信號肽預(yù)測

從預(yù)測結(jié)果可以看出，絲素重鏈的C末端氨基酸殘基之間存在一定的疏水性差異(圖2-A)，少部分位置的氨基酸殘基具有疏水性，絕大部分氨基酸殘基具有親水性?？傮w而言，整個Fib-H的C末端結(jié)構(gòu)域?qū)儆谟H水性的蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，C末端結(jié)構(gòu)域中不存在信號肽(圖2-B)?？缒ぢ菪Y(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)ib-H的C末端不含有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖2-C)。

根據(jù)以上結(jié)果，推測C末端可能與新生絲素重鏈的分泌過程無關(guān)，但C末端的親水性特征可能對絲素重鏈的折疊和組裝具有重要意義。

2.2 Fib-HC末端基因克隆

根據(jù)Fib-HC末端的堿基序列設(shè)計引物 Fib-HC-F和Fib-HC-R，用家蠶后部絲腺 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示出一條約175bp的片段，大小與預(yù)期相符(圖3)。PCR擴(kuò)增獲得的基因片段經(jīng)切膠回收后連接到載體 pET-50b(+)上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α后，擴(kuò)大培養(yǎng)，從菌液中提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和菌液PCR驗證(圖4)。雙酶切鑒定和菌液PCR驗證的結(jié)果均表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果顯示，克隆獲得的序列與Pubmed上登錄的序列一致，表明我們成功地獲得了Fib-H C末端的堿基序列。

2.3 融合蛋白的表達(dá)純化

將測序驗證正確的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)后，在大腸桿菌中利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過誘導(dǎo)條件的摸索，最終選用0.2mM IPTG、16℃、20 h的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖5所示。

對融合蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳柱親和純化的方法對目的蛋白進(jìn)行了大量純化，在80～500 mM的咪唑濃度梯度下洗脫獲得了比較純凈的融合蛋白。結(jié)果如圖6所示。

圖2 Fib-H C末端氨基酸殘基疏水性分析(A)、信號肽預(yù)測(B)和跨膜螺旋預(yù)測(C)

圖3 目的基因PCR 擴(kuò)增

圖4 雙酶切檢測和菌液PCR

圖5 融合蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

圖6 融合蛋白純化結(jié)果

圖7 Westernblotting驗證融合蛋白的表達(dá)

2.4 Westernblotting鑒定

為進(jìn)一步驗證融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，我們利用商業(yè)化的組氨酸蛋白標(biāo)簽抗體，按照Western blotting 的實驗方法檢測了蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖7所示。

3 討 論

絲素重鏈?zhǔn)切Q絲纖維的主要結(jié)構(gòu)組分，絲素重鏈的結(jié)構(gòu)決定了蠶絲纖維的物理和化學(xué)性能，因此研究絲素重鏈蛋白的結(jié)構(gòu)和組裝對于解析蠶絲纖維結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系非常重要。之前的研究表明，F(xiàn)ib-H的N末端結(jié)構(gòu)域隨著pH值從中性到酸性的改變，可以從二聚體結(jié)構(gòu)逐步發(fā)生寡聚化，進(jìn)一步誘導(dǎo)了Fib-H的聚集和自組裝。然而Fib-H的C末端結(jié)構(gòu)域在Fib-H的折疊和組裝過程中發(fā)揮什么樣的作用當(dāng)前并不清楚。

氨基酸序列分析表明，F(xiàn)ib-HC末端結(jié)構(gòu)域具有一定的水溶性，含有約35%的α-Helix和β-sheet結(jié)構(gòu)。為研究Fib-HC末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能，本文以家蠶5齡3d后部絲腺cDNA為模板，克隆獲得了Fib-HC末端的堿基序列。由于該蛋白分子量相對較小，僅約6.2 kDa，難以表達(dá)純化，因此將其構(gòu)建到pET-50b(+)表達(dá)載體上，與NusA蛋白融合表達(dá)。融合蛋白在0.2 mM，16℃的誘導(dǎo)條件下，主要以可溶性蛋白的形式在上清中表達(dá)，經(jīng)過鎳柱親和層析純化，獲得了較純的目的蛋白。利用組氨酸蛋白標(biāo)簽抗體，經(jīng)Western blotting檢測，確證為His-NusA與Fib-H C的融合蛋白。為了提高目的蛋白的表達(dá)量，方便后期的蛋白純化，我們采取了將His-NusA與Fib-H C融合表達(dá)純化的策略，接下來還需要將His-NusA與Fib-H C分離并純化獲得Fib-H C，這是我們需要進(jìn)一步面對和解決的問題。無論如何，該研究都為深入揭示Fib-H C末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能邁出了非常重要的一步。隨著家蠶基因組框架圖的繪制以及家蠶基因功能研究的不斷發(fā)展[7]，相信將來一定可以解析蠶絲纖維結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系奧秘。

[1] 向仲懷. 蠶絲生物學(xué)(第一版)[M]. 北京：中國林業(yè)出社，2005.

[2] Inoue S，Tanaka K，Arisaka F，etal. Silk fibroin ofBombyxmoriis secreted，assembling a high molecular mass elementary unit consisting of H-chain，L-chain，and P25 with a 6:6:1 molar ratio[J]. Journal of Biological Chemistry,2000,275(51):40517-40528.

[3] Shao Z Z， Fritz Vollrath. Materials：Surprising strength of silkworm silk[J]. Nature,2002,418(6899):741-741.

[4] Zhou Z C， Li Z G. Fine organization ofBombyxmorifibroin heavy chain gene[J]. Nuc. AcidsRes,2000,28(4):2413-2419.

[5] Zhou C Z，Confalonieri F，Jacquet M，etal. Silk fibroin：structural implications of a remarkable amino acid sequence[J]. Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics,2001,44(2):119-122.

[6] He Y X，Zhang N N，Li W F，etal. N-Terminal domain ofBombyxmorifibroin mediates the assembly of silk in response to pH decrease[J]. Journal of Molecular Biology,2012,418(3):197-207.

[7] Xia Q，Zhou Z，Lu C，etal. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (Bombyxmori)[J]. Science,2004,306(5703):1937-1940.

Sequence Analysis, Cloning, Expression and Purification of Fibroin Heavy Chain C-terminal

LIU Qing-song1,2,#LI Yu1,2,#LI Zhen-zhen1,3LIU Li-na1WANG Ye-jing1,2HE Hua-wei1,2,3*

(1.Statekeylaboratoryofsilkwormgenomebiology;2.Collegeofbiotechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;3.NationallaboratoryofBiomacromolecules,InstituteofBiophysics,Chineseacademyofsciences,Beijing100101,China)

Silk is mainly composed of fibroin and sericin proteins. Fibroin includes fibroin heavy chain, light chain and P25 protein. It is difficult to study the structure of fibroin heavy chain because it is hard to express and purify such a high molecular weight protein in vitro.. In this study, we analyzed the sequence offibroinheavychaingene and cloned its C-terminal nucleotide fragment by using the cDNA from the posterior silk gland of fifth instar 3d silkworm as a template. Then the fragment was subcloned into pET-50b(+) expression vector. Subsequently, the vector was transferred into E. coli and induced by IPTG to express the C-terminal fragment of fibroin heavy chain. The recombinant NusA-fused protein was purified by nickel affinity chromatography column. Our research will shed light on the folding and assembling of silk protein.

Bombyxmori；Fibroin heavy chain；C-terminal；Cloning；Expression and purification

*# 作者對此論文具有同等貢獻(xiàn)基金項目：西南大學(xué)“國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”項目(201410635046)，生物大分子國家重點實驗室開放基金(2015kf08)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(SWU112111，XDJK2013A019，SWU112086，XDJK2013C049)。

何華偉，博士，教授。Email：hehuawei@swu.edu.cn