大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP表達(dá)變化

袁建清，廖春英，黃櫻

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州 341000)

摘要：目的觀察新型雙孔鉀離子通道亞單元TREK-1及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)的表達(dá)變化。方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注模型，應(yīng)用免疫熒光組化和激光掃描共聚焦觀察正常大鼠及MCAO 再灌注后3、7、30天海馬CA1區(qū)TREK-1和GFAP表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)大鼠MCAO 再灌注后3、7、30天海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP蛋白表達(dá)。結(jié)果成年大鼠海馬CA1區(qū)可見TREK-1和GFAP雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞，而未見有TREK-1和NEUN雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞；MCAO 再灌注后3、7、30天海馬CA1區(qū)TREK-1和GFAP表達(dá)逐步上調(diào)，與正常大鼠比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP表達(dá)均升高。

關(guān)鍵詞：腦缺血；海馬；TREK-1；鉀離子通道；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；星形膠質(zhì)細(xì)胞

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.014

中圖分類號(hào)：R743.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-08-11)

通信作者：黃櫻

星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血病理過程中起重要作用，在缺血后不同時(shí)程，增殖活化不同，有保護(hù)或加重神經(jīng)元損傷的功能[1，2]。研究[3～5]表明，TREK-1通道可能參與了腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用，雙孔鉀通道TREK-1表達(dá)于成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，介導(dǎo)線性I-V關(guān)系的背景K離子電流和低的膜電位，有助于調(diào)控水及離子動(dòng)態(tài)平衡、清除興奮性毒性物質(zhì)、氧自由基，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。大鼠腦缺血后海馬TREK-1表達(dá)情況及與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚少見報(bào)道。2013年5月，我們觀察了大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型(MCAO)腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)TREK-1及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)變化，探討TREK-1與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系，為探索腦缺血治療的新的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料成年(3月齡)健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，由贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔抗TREK-1購(gòu)于以色列Alomone Labs公司，小鼠抗NEUN購(gòu)于美國(guó)Chemicon公司，小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)購(gòu)于美國(guó)Neomarkers公司，異硫氰酸熒光素( FITC) 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和花青素(Cy3) 標(biāo)記的驢抗兔IgG購(gòu)于美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司。普通小牛血清、普通羊血清和普通驢血清購(gòu)于美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司，Cocktail (蛋白酶抑制合劑)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，ECL顯色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。恒冷切片機(jī)(德國(guó)Leica公司CM1900型)，激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司FV500型)，臺(tái)式低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司5804R型)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rid公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Gene Genius公司)。

1.2MCAO制備及分組應(yīng)用線栓法[6,7]建立MCAO模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)(sham)組、MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 30 d組，每組12只，6只用于免疫組化檢測(cè)，6只用于Western blotting檢測(cè)。術(shù)前12 h禁食，自由進(jìn)水。用6%水合氯醛麻醉(300 mg/kg體質(zhì)量)，術(shù)中維持動(dòng)物直腸溫度(36.6±0.5)℃。分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，注意避免刺激迷走神經(jīng)。于頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅膠的4-0絲線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度為距離頸總動(dòng)脈分叉處1.8～2.0 cm，1 h后拔出絲線進(jìn)行再灌注。按Longa等[7]神經(jīng)功能評(píng)分1～3分者入選MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 30 d組。假手術(shù)組除不插線栓外余步驟同上, 并于24 h后取材。術(shù)后在約20 ℃的環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.3缺血后大鼠海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP表達(dá)檢測(cè)①定性檢測(cè)：采用熒光免疫組化法。造模后的各組大鼠快速斷頭取腦，將腦組織置于-80 ℃冷凍保存。-20 ℃恒冷切片機(jī)自視交叉處開始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片。冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4 ℃)固定15 min，PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驢血清(NDS/PBS)封閉液封閉2 h，棄血清，將相連切片分成兩組，分別滴加兔抗TREK-1(1∶200)、小鼠抗GFAP(1∶200)或兔抗TREK-1(1∶200)、小鼠抗NEUN(1∶200)進(jìn)行雙標(biāo)，4 ℃孵育過夜；PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加羊抗小鼠FITC(1∶200)和驢抗兔Cy3(1∶200),室溫避光孵育1 h，流水沖洗40 min后，50%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為550/565 nm的CY3呈紅色熒光，表示TREK-1蛋白；激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm的FITC呈綠色熒光，表示神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞染色；雙標(biāo)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞為黃色。②定量檢測(cè)：采用Western blotting法。造模后的各組大鼠在腦缺血后相應(yīng)時(shí)點(diǎn)快速斷頭取腦，在冰上迅速剝離出右側(cè)海馬，然后進(jìn)行樣品的制備、蛋白溶度的測(cè)定、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)移電泳至PVDF膜，最后進(jìn)行免疫酶染色，其過程如下：0.1%TBST洗PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗即兔抗TREK-1(1∶200)，4 ℃緩慢動(dòng)搖過夜，0.1%TBST洗PVDF膜, 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗IgG(1∶1 000)，室溫緩慢搖動(dòng)1 h, ECL顯色液顯色，高敏膠片攝片洗片。另增加內(nèi)參照蛋白β-actin檢測(cè)(兔抗β-actin，1∶200)，陰性對(duì)照組不加一抗，其余相同。測(cè)定Western blotting蛋白條帶的光密度(OD)值。

2結(jié)果

2.1大鼠海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP的定性表達(dá)TERK-1呈紅色熒光，雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞呈黃色。TREK-1選擇性地表達(dá)于星型膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元上未見有表達(dá)。在大鼠海馬CA1區(qū)可見形態(tài)正常呈樹根狀或放射狀的綠色熒光的星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)，亦可見到形態(tài)正常的呈綠色熒光的神經(jīng)元(NEUN陽(yáng)性)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，NEUN是神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，二者均呈綠色熒光。應(yīng)用免疫熒光和激光掃描共聚焦觀察，MCAO再灌注后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大呈活化狀態(tài)，缺血再灌注后3、7、30 d 可見TREK-1和GFAP表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

2.2MCAO再灌注后海馬CA1區(qū)TREK-1、GFAP表達(dá)變化Sham、MCAO 3 d、MCAO 7 d和MCAO 30 d組海馬區(qū)TREK-1蛋白表達(dá)水平分別是0.46±0.09、0.90±0.10、1.12±0.17和1.70±0.24，GFAP蛋白表達(dá)水平分別是0.40±0.07，0.74±0.08，0.94±0.14和1.40±0.20,Sham組與其他三組比較，P均<0.05；MCAO 30 d組與MCAO 3 d、MCAO 7 d組比較，P<0.05。

3討論

雙孔鉀離子通道(K2P，KCNK)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型鉀離子通道，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(6TMS)和2個(gè)孔道結(jié)構(gòu)(2P)，廣泛分布于各種組織，在可興奮細(xì)胞和非可興奮細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)[4]。通過鼠類中樞神經(jīng)系統(tǒng)K2p基因原位雜交研究顯示，在所有的雙孔鉀離子通道亞型中，有7種表達(dá)于成年鼠類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括TASK-1、TASK-3、TWIK-1、 THIK-1、TRAAK、TREK-1和TREK-2[8,9]。K2P對(duì)經(jīng)典的鉀離子通道阻滯劑如四已基胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)等不敏感[4]，但能被體內(nèi)外眾多生理病理因子及化學(xué)、機(jī)械刺激所調(diào)控[4,5,8]，包括多聚不飽和脂肪酸、神經(jīng)遞質(zhì)、溶血磷脂酸、第二信使、揮發(fā)性麻醉劑、臨床上的某些神經(jīng)保護(hù)劑，還有細(xì)胞內(nèi)外的pH值、滲透壓、氧分壓的改變、溫度變化及機(jī)械牽張等。K2P表達(dá)具有線性I-V關(guān)系的背景K電流，其電流是瞬時(shí)性和非失活性的，不具有時(shí)間和電壓依賴性[4,5]，參與調(diào)節(jié)背景鉀電流，在細(xì)胞膜電位的復(fù)極化和膜靜息電位的形成中起重要作用，并能穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性[4]。

TREK-1是雙孔鉀離子通道的一種亞型，通過TREK-1基因敲除的小鼠研究表明，TREK-1在腦缺血中起著重要的腦保護(hù)作用，TREK-1-/-的小鼠對(duì)腦缺血損傷的敏感性明顯增加[10]。腦缺血過程中，花生四烯酸釋放，細(xì)胞內(nèi)pH值下降，神經(jīng)元發(fā)生腫脹。這些病理改變可在突觸前后開放 TREK-1。通道開放導(dǎo)致的超極化會(huì)抑制突觸前膜上電壓門控的鈣通道激活從而減少谷氨酸的釋放。在突觸后膜，超極化能加強(qiáng)鎂離子在負(fù)的膜電位下對(duì)NMDA受體的阻斷效應(yīng)，這樣就減少了鈣離子的內(nèi)流，從而降低谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和興奮毒性。突觸后水平TREK-1的開放還會(huì)對(duì)抗由離子型谷氨酸受體的激活引發(fā)的去極化。相反地，刺激代謝型谷氨酸受體會(huì)導(dǎo)致TREK-1的關(guān)閉，減少其神經(jīng)保護(hù)作用[10,11]。

近年來對(duì)腦缺血研究一直集中于神經(jīng)元，但迄今尚無有效根治措施。研究[12,13]表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血病理過程中起重要作用。腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大增生，呈活化狀態(tài)，即GFAP表達(dá)增強(qiáng)，不同時(shí)程可發(fā)揮保護(hù)或損害神經(jīng)元的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用依賴于其表達(dá)特征性的具有線性I-V關(guān)系的被動(dòng)電傳導(dǎo)，且具有低的膜電位(-75 mV)及低的膜電阻[14]。有研究[15]通過細(xì)胞培養(yǎng)離體實(shí)驗(yàn)表明TREK-1功能性表達(dá)于海馬區(qū)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞，腦缺血后TREK-1與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有一定關(guān)系，并認(rèn)為腦缺血時(shí)所產(chǎn)生的損傷因子可能通過作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞K2P來影響膠質(zhì)細(xì)胞的活化增植及緩沖功能，從而影響神經(jīng)元的命運(yùn)。

本實(shí)驗(yàn)通過在體研究發(fā)現(xiàn)，鼠海馬CA1區(qū)TREK-1選擇性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，MCAO再灌注后，海馬TREK-1表達(dá)逐步上調(diào)且與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有一定關(guān)系。

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