劉蓮蓮　楊海瑩　張應(yīng)龍?。á偕綎|商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院　山東 濟(jì)南　250103②國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心　山東 濟(jì)南）

基因敲出豬器官移植研究進(jìn)展

劉蓮蓮①②楊?，摙佗趶垜?yīng)龍①②（①山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院山東 濟(jì)南250103②國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心山東 濟(jì)南）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有6.3萬(wàn)多病人需要接受器官移植，而可供移植的器官卻只有約2萬(wàn)多；我國(guó)每年大約有10萬(wàn)人需要器官移植，然而能找到供體器官的僅有約2000人，器官不足較西方國(guó)家更為突出。為有效緩解器官供需間日益突出的矛盾，異種器官移植作為解決供者器官不足的重要戰(zhàn)略之一，近年來(lái)再次得到廣泛關(guān)注和深入研究［1］。

1　器官移植的排斥反應(yīng)及機(jī)理

當(dāng)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的器官異種移植給人類時(shí)，會(huì)發(fā)生幾種機(jī)制不同的免疫排斥反應(yīng)：（1）超急性排斥反應(yīng)（HAR）：被移植的器官，在5min內(nèi)就會(huì)變黑，壞死，其機(jī)理是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞表面，含有一種被成為半乳糖的物質(zhì)。在長(zhǎng)期的生命進(jìn)化中，這種物質(zhì)在靈長(zhǎng)類包括人中已經(jīng)消失，但存在于所有豬的血管內(nèi)皮的表面，這種半乳糖被稱之為G抗原；G抗原激活了病人體內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)，最終導(dǎo)致移植物的壞死；此外，供者組織細(xì)胞表面的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白與人補(bǔ)體成分不協(xié)同，不能抑制人補(bǔ)體激活及其溶細(xì)胞作用，這也是發(fā)生超急性排斥反應(yīng)（HAR）的原因之一。（2）急性體液性異種排斥反應(yīng)（AHXR）：由于異種抗原刺激受者免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生誘生抗體，繼而導(dǎo)致補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，病理特點(diǎn)為移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損并伴有DIC，鏡下表現(xiàn)為內(nèi)皮損傷，血管內(nèi)血栓形成［2］。

2　豬器官移植的研究

（1）有學(xué)者開(kāi)發(fā)了可表達(dá)人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（CRP）的轉(zhuǎn)基因豬，如人衰變加速因子（hDAF，CD55），膜輔蛋白（MCP，CD46），膜反應(yīng)性溶破抑制因子（CD59）和C1酯酶抑制劑（C1-INH）［3］。盡管利用親和吸附技術(shù)和繁育轉(zhuǎn)基因豬表達(dá)人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的方法可以使受體體內(nèi)Gal抗體暫時(shí)去除，然而，異種天然抗體（XNA）的再生成以及殘留的補(bǔ)體活性最終可導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)（HAR）。（2）另一種方法是繁育α-1，3半乳糖基因敲除的豬來(lái)去除細(xì)胞表面的半乳糖，解決超急性排斥反應(yīng)（HAR）。Lai等和Dai等采用基因打靶和體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移相結(jié)合技術(shù)，成功地獲得了雜合的α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬［4-5］。Phelps等利用2次循環(huán)基因敲除和克隆技術(shù)成功繁育出純合的α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬［6］。人們利用基因修飾豬進(jìn)行了包括腎臟、心臟、肝臟和肺臟在內(nèi)的實(shí)質(zhì)臟器的異種移植并取得了一定成果。Zaidi等［7］進(jìn)行了13例豬-獼猴腎移植，其中7只為人衰變加速因子（hDAF）轉(zhuǎn)基因豬腎，6只對(duì)照，術(shù)后獼猴均進(jìn)行了免疫抑制治療，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組平均成活時(shí)間為13d，對(duì)照組平均成活時(shí)間為6.5d。Yamada等［8］將α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除（GT-KO）的豬的腎移植到免疫抑制的狒狒的體內(nèi)，存活了83d克服了超急性血管排斥。不過(guò)Chen［9］報(bào)道的結(jié)果并不樂(lè)觀，由于受體內(nèi)出現(xiàn)抗-非α-半乳糖抗原-抗體，導(dǎo)致急性體液性排斥反應(yīng)，使受體出現(xiàn)消耗性凝血病。2004年Kuwaki等人［10］將α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除（GT-KO）的豬的心臟移植到狒狒的體內(nèi)，存活了2～6個(gè)月，避免了超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，而移植物失活是由于微循環(huán)血栓形成導(dǎo)致血管閉塞和周?chē)M織缺血所引起。凝血功能障礙與早期移植物功能失活密切相關(guān)。在α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除（GT-KO）豬基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)抗凝蛋白基因如TFRI或CD39有望解決這一問(wèn)題。

3　小腸移植的研究

（1）小腸移植是指將一定長(zhǎng)度或全部的異體小腸通過(guò)血管吻合、腸道重建的方式移植給因解剖和（或）功能性原因?qū)е滦∧c解剖結(jié)構(gòu)缺如和（或）消化、吸收功能喪失，需要依靠營(yíng)養(yǎng)支持來(lái)維持生命的患者，通過(guò)免疫抑制劑等一系列治療使移植腸在患者體內(nèi)有功能存活，并依靠小腸維持患者生命，甚至恢復(fù)勞動(dòng)力的醫(yī)療技術(shù)。小腸移植的適應(yīng)癥如下：①短腸綜合征引起的小腸功能衰竭；②腸蠕動(dòng)失調(diào)征；③先天性腸表皮粘膜疾病；④血管性疾病、腸扭轉(zhuǎn)、外傷等造成小腸壞死、施行廣泛小腸切除而發(fā)生的短腸綜合征、Gardner綜合征、放射性小腸炎、Crohn病、壞死性小腸結(jié)腸炎等。短腸綜合征是單獨(dú)小腸移植的最常見(jiàn)原因［11］。（2）小腸移植在大器官移植中是難度最大、發(fā)展最緩慢的器官移植之一。首例臨床小腸移植于1964年實(shí)施，受者為一例嬰兒，供者為其母親，術(shù)后12h死亡［12］。此后，加拿大、美國(guó)、法國(guó)、德國(guó)等國(guó)家相繼開(kāi)展，最長(zhǎng)時(shí)間存活僅6個(gè)月。主要原因是移植后可發(fā)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)和嚴(yán)重的感染，這一切是因?yàn)樾∧c器官本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的。小腸屬于空腔臟器，有豐富的腸系膜淋巴結(jié)、集合淋巴結(jié)，以及腸粘膜固有層中含有大量的淋巴組織，腸腔內(nèi)有大量的微生物聚集，腸上皮細(xì)胞表面表達(dá)組織相容性抗原Ⅱ類分子等，這些特點(diǎn)決定了小腸移植較其他實(shí)質(zhì)性臟器的移植更容易發(fā)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)及移植物抗宿主反應(yīng)和嚴(yán)重的感染。20世紀(jì)80年代，免疫抑制劑環(huán)孢素A的應(yīng)用使小腸移植進(jìn)入臨床起初階段；進(jìn)入20世紀(jì)90年代中期，免疫抑制劑他克莫司（FK560）應(yīng)用為小腸移植開(kāi)辟了新紀(jì)元；21世紀(jì)初抗胸腺球蛋白或CD52單克隆抗體誘導(dǎo)加他克莫司能有效控制排斥反應(yīng)，全球小腸移植數(shù)量逐漸增多［13］。目前先進(jìn)的小腸移植中心移植后患者和移植臟器1年存活率分別達(dá)到92%和89%［14］。隨著小腸移植在臨床的廣泛開(kāi)展，供腸來(lái)源也會(huì)象腎、心、肝臟移植一樣嚴(yán)重缺乏，異種移植將可能是解決供求矛盾的辦法。（3）曾有學(xué)者進(jìn)行了小腸異種移植的研究，發(fā)現(xiàn)受體對(duì)移植物產(chǎn)生嚴(yán)重的超急性排斥反應(yīng)［15-17］，但有關(guān)利用基因修飾豬進(jìn)行小腸異種移植的研究尚未報(bào)道，為此本實(shí)驗(yàn)將以α-1，3半乳糖基因敲除豬為供體，將節(jié)段性小腸移植到狒狒體內(nèi)，建立α-1，3半乳糖基因敲除豬-狒狒小腸移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用抗胸腺球蛋白誘導(dǎo)加他克莫司抑制排斥反應(yīng)，觀測(cè)小腸移植物的存活情況，檢測(cè)能否克服超急性排斥反應(yīng)，闡明移植物失活的原因，初步探討小腸異種移植免疫排斥機(jī)理及解決策略，為小腸異種移植的臨床應(yīng)用建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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中圖分類號(hào)：S828.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2015）01-0081-02

收稿日期：（2014-10-28）