抑制白細(xì)胞介素-17活性短肽疫苗對(duì)ApoE-/-小鼠免疫功能的影響

王順

(湖北省武漢市第一醫(yī)院, 湖北 武漢, 430022)

關(guān)鍵詞:抑制IL-17活性短肽疫苗; ApoE-/-小鼠; 安全劑量; 免疫功能

白細(xì)胞介素17(IL-17)是近年來發(fā)現(xiàn)的又一新的細(xì)胞因子[1]，它主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生, 能誘導(dǎo)多種基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種前炎性細(xì)胞因子和造血活性因子, 如白細(xì)胞介素-6(IL- 6),白細(xì)胞介素-8(IL-8), 粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1), 前列腺素E2(PGE2)等[2-3]。IL-17可通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)造成組織損害，如在關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥(MS)/EAE、銀屑病、腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等多種自身免疫性疾病[4-5]中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-17 亦參與調(diào)節(jié)粒細(xì)胞生成(通過誘導(dǎo)G-CSF表達(dá))[6-9]及宿主防御反應(yīng)。有研究[10-11]表明，冠心病患者和AS小鼠體內(nèi)存在Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)。本課題組前期用4個(gè)IL-17的肽段偶聯(lián)后獲得疫苗免疫新西蘭兔，篩選出能產(chǎn)生高滴度抗體且該抗體對(duì)IL-17活性抑制率高的肽段(0002)。本實(shí)驗(yàn)通過ApoE-/-小鼠實(shí)驗(yàn)研究該疫苗的安全有效使用劑量及對(duì)ApoE-/-小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

SPF級(jí)ApoE-/-小鼠，購自Jackson試驗(yàn)室(Bar Harbor, Maine, 美國)，由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。50 mmol/L Na2CO3(pH 9.6), 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)或10 mmol/L PBS(pH 7.2), 0.02%～0.05% Tween-20的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液或者Tris鹽緩沖液(pH 7.4)。

1.2IL-17活性的短肽疫苗制備

通過文獻(xiàn)閱讀分析出IL-17的功能位點(diǎn)，用DNAStar分析IL-17的氨基酸序列的親水性、抗原性及二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)4條肽段，并通過前期實(shí)驗(yàn)篩選出了能產(chǎn)生高滴度抗體且該抗體對(duì)IL-17活性抑制率高的肽段。

1.3IL-17活性的短肽疫苗小鼠毒性試驗(yàn)

選取8周齡健康雄性ApoE-/-小鼠分為12組，每組5只，分別以5、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200 μg/只的劑量行腹腔注射IL-17活性的短肽疫苗。觀察1周內(nèi)動(dòng)物健康狀態(tài)、有無異常反應(yīng)、中毒癥狀及死亡情況。

1.4IL-17活性的短肽疫苗對(duì)小鼠血清特異性抗體的影響

選取8周齡健康雄性ApoE-/-小鼠20只，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組注射IL-17活性的短肽疫苗，劑量0.1 mL; 對(duì)照組注射生理鹽水，劑量0.1 mL。于0、2、4、6周共免疫4次，并分別對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行剪尾取血，分離血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｐ∈笱逯刑禺愋钥贵w效價(jià)測(cè)定：利用間接ELISA方法測(cè)定小鼠血滴中特異性抗體的效價(jià)。以IL-17作為捕獲抗原溶于包被液(0.5 mg/mL, pH 9.6碳酸鹽緩沖液)中，并在ELISA板上每孔加人100 μL, 于4 ℃保存過夜。次日用洗滌緩沖液PBS-Tween 20洗滌3次，甩干。將封閉液以每孔200 μL的量加入，于37 ℃封閉90 min同樣用PBS-Tween 20洗滌3次。將各待檢血清稀釋200倍，每孔中加入100 μL, 同時(shí)以未免疫的小鼠血清為陰性對(duì)照，以前期實(shí)驗(yàn)分離純化的抗IL-17抗體為陽性對(duì)照。于37 ℃孵育90 min后，按上述同樣方法洗滌3次。每個(gè)孔中加100 μL二抗, 37 ℃孵育90 min后，再次洗板3次。隨后每孔加入100 μL的TMB, 37 ℃下顯色30 min, 最后加入50 μL(2 mol/L)的H2SO4終止反應(yīng)。并于405 nm下測(cè)定其OD值，當(dāng)(OD待檢樣品-OD空白對(duì)照)/(OD陰性對(duì)照-OD空白對(duì)照)≥2時(shí)判定為陽性。以陽性對(duì)照樣品進(jìn)行ELISA測(cè)定的效價(jià)建立OD值與ELISA滴定效價(jià)的函數(shù)關(guān)系來計(jì)算抗體效價(jià)。

2結(jié)果

2.1IL-17活性的短肽疫苗體內(nèi)毒性試驗(yàn)及安全劑量

在給ApoE-/-小鼠注射了IL-17疫苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，劑量為5、10、15、20、25 μg/只時(shí)，ApoE-/-小鼠無任何異常癥狀，為安全劑量；當(dāng)劑量為30、40、50、60、80 μg/只時(shí)，ApoE-/-小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩等不良癥狀，但沒有死亡；當(dāng)劑量為100、200 μg/只時(shí), ApoE-/-小鼠出現(xiàn)了明顯的不良癥狀，開始死亡。

2.2IL-17疫苗對(duì)ApoE-/-小鼠血清特異性抗體效價(jià)的影響

IL-17疫苗免疫后，ApoE-/-小鼠血清中特異性抗體效價(jià)(1og2)發(fā)生變化。在免疫2周時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組免疫后的平均效價(jià)都無顯著變化(P>0.05)。在免疫后的第6周，試驗(yàn)組抗體效價(jià)平均為10.3, 顯著高于同期對(duì)照組(P<0.05), 說明IL-17疫苗在ApoE-/-小鼠休內(nèi)能到達(dá)免疫效果。

3討論

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，與其相關(guān)的冠心病是全世界范圍的重要死因。近年來研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是一種與免疫有關(guān)的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，由效應(yīng)性T細(xì)胞功能異常介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和斑塊的破裂中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用，斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞及其炎癥產(chǎn)物對(duì)粥樣斑塊脂質(zhì)中心的擴(kuò)大、纖維組織完整性的破壞及細(xì)胞外基質(zhì)的不斷降解均有重要作用。冠狀動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)參與了動(dòng)脈粥樣硬化和血栓的形成過程，在血管的收縮、舒張、痙攣和血栓形成等過程中發(fā)揮極其重要的作用，但觸發(fā)炎癥反應(yīng)的原因尚未明確。IL-17是近年來備受關(guān)注的一種細(xì)胞因子，它主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生, 能誘導(dǎo)多種基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種前炎性細(xì)胞因子和造血活性因子, 如IL- 6、IL- 8、GCSF、TNF、IL- 1、PGE2等，同時(shí)IL-l7可促進(jìn)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，并與TNF-α及IL-1等細(xì)胞因子有著復(fù)雜的聯(lián)系[12], 在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中處于關(guān)鍵地位。IL-17和其特異性受體同樣在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要作用，IL-17可通過激活巨噬細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白，使單核細(xì)胞聚集并進(jìn)入血管內(nèi)皮下，同時(shí)還促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面LDL受體的合成及巨噬細(xì)胞對(duì)LDL的攝取，促進(jìn)粥樣斑塊形成。IL-17還可調(diào)節(jié)黏附分子和Thl細(xì)胞，促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中，血管內(nèi)皮的損傷可引起TNF-α的大量釋放，而TNF-α又可促進(jìn)IL-17的釋放，二者通過協(xié)同作用造成血管內(nèi)皮下免疫復(fù)合物沉積，進(jìn)而形成血栓。IL-17還通過與TNF-α的協(xié)同作用，作用于微環(huán)境導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，從而促進(jìn)冠心病的進(jìn)展。IL-17尚可通過MAP激酶途徑和NF-kB-DNA途徑介導(dǎo)全身的炎癥反應(yīng)。目前研究[13]認(rèn)為, IL-17通過血管壁上IL-17受體上調(diào)產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化損害并引起系統(tǒng)炎癥，IL-17水平升高還可通過激活巨噬細(xì)胞系統(tǒng)引起動(dòng)脈損害進(jìn)一步加重。有研究結(jié)果顯示，有動(dòng)脈粥樣硬斑塊形成的ApeE(-/-)小鼠動(dòng)脈血管壁的IL-17水平與對(duì)照組比較有明顯升高, Th17細(xì)胞增加的比例與斑塊的大小成正相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)可以用中和性抗IL-17Ab阻止其斑塊的發(fā)展。將抗中和性抗IL-17 Ab輸入小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠動(dòng)脈斑塊面積、最大狹窄、平均狹窄程度均較對(duì)照組有明顯下降；斑塊較穩(wěn)定，纖維帽增厚，膠原及平滑細(xì)胞增加。研究者在體外用IL-17刺激平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及DC，發(fā)現(xiàn)其炎性反應(yīng)加重。同時(shí)有研究[14]表明, IL-l7抗體、IL-17R、IgG1Fc融合蛋白、IL-17特異性可溶性受體或特異性抑制劑及IL-17R的單抗可不同程度地阻斷IL-17的部分效應(yīng)。已有研究[15]表明，用IL-17抗體中和IL-17后, RA經(jīng)典動(dòng)物模型—膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠早期關(guān)節(jié)炎癥減輕或消失，晚期CIA小鼠的骨損傷能夠有一定程度的恢復(fù)。因此, IL-l7疫苗在IL-17相關(guān)疾病治療中展示出了良好的前景。

參考文獻(xiàn)

[1]Rouvier E, Luciani M F, Mattei M G, et al. CTLA-8, cloned f rom an act ivated T Cell, bearing AU-Rich messenger RNA instability sequences,and homlogous to a Herpesvirus Saimirigene[J]. J Immunol, 1993, 150: 5445.

[2]Fossiez f, Djossou O, Chomarat p, et al. T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines[J]. J Exp Med, 1996, 183(6): 2593.

[3]Spriggs M K. Int erleukin-17 and its recepter[J]. J Clin Immunol, 1997, 17(5): 366.

[4]Nakae, S, Nambu, A, Sudo, K & Iwakura, Y. Suppression of immune induction ofcollagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice[J]. J Immunol, 2003, 171: 6173.

[5]Bush K A, Farmer K M, Walker J S. Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein[J]. Arthritis Rheum, 2002, 46: 802.

[6]Hurst S D, Muchamuel T, Gorman D M, et al. New IL-17 family members promote Th1 or Th2 responses in the lung: in vivo function of the novel cytokine IL-25[J]. J Immunol, 2002, 169: 443.

[7]Schwarzenberger P, Huang W, Ye P, et al. Requirement of endogenous stem cell factor and granulocyte-colony-stimulating factor for IL-17-mediated granulopoiesis[J]. J Immunol, 2000, 164: 4783.

[8]Schwarzenberger P, La Russa V, Miller A, et al. IL-17 stimulates granulopoiesis in mice: use of an alternate, novel gene therapy-derived method for in vivo evaluation of cytokines[J]. J Immunol, 1998, 161: 6383.

[9]Tan W, Huang W, Zhong Q. IL-17 receptor knockout mice have enhanced myelotoxicity and impaired hemopoietic recovery following gamma irradiation[J]. J Immunol, 2006, 176: 6186.

[10]Cheng X, Yu X, Ding Y J, et al. The Th17/Treg imbalance in patients with acute coronary syndrome[J]. Clin Immunol, 2008, 127: 89.

[11]Xie J J, Wang J, Tang T T, et al. The Th17/Treg functional imbalance during atherogenesis in ApoE(-/-) mice[J]. Cytokine, 2010, 49(2): 185.

[12]張志剛. IL-17的生物學(xué)特性及臨床意義[J]. 國外醫(yī)學(xué): 生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè), 2003, 23(6): 639.

[13]Stwat H. gong QT-Role of interleukin-17 and interleukin-17-induced cyto-kines inerleukin and interleukin 8 in unstable coronary artery disease[J]. Path Nat His, 2006, 17(8): 699.

[14]Witowski J, Pawlaczyk K, Brebarowicz A, et al. IL-17 stim-ulates intraperitoneal neutrophil infiltration through the re-lease of Croalpha chemokine from mesothelial cells[J]. JImmunol, 2000, 165 (10): 5814.

[15]Bush K A, Farmer K M, Walker J S, et al. Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgGIFc fusion pro-tein[J]. Arthritis Rheum, 2002, 46 (3): 802.

收稿日期:2014-11-18

中圖分類號(hào):R 392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)03-126-02

DOI:10.7619/jcmp.201503041