豬流感的檢測與診斷

成大勇 （內蒙古赤峰市家畜改良工作站 024031） 翁善鋼（外高橋出入境檢疫局 上海 浦東）

豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)是豬常見的病原體之一。SIV為正粘病毒科甲型流感病毒屬成員。各種年齡、性別和品種的豬均能感染，母豬群中檢測出甲型流感病毒陽性的概率相對較高。臨床上往往表現(xiàn)為急性呼吸道疾病，主要癥狀有發(fā)熱，厭食，體重減輕，嗜睡，咳嗽，呼吸困難，鼻和眼有分泌物排出。母豬會出現(xiàn)繁殖障礙和流產(chǎn)。此外，感染流感病毒之后還會繼發(fā)細菌性感染。豬流感發(fā)病率高，恢復緩慢，阻礙增重，降低料肉比，直接影響豬群健康狀態(tài)和質量，是規(guī)?；B(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的豬群發(fā)性疾病之一，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。自1918年首次報道豬流感以來，迄今為止，世界各大洲均有豬流感的發(fā)生和流行。迄今已發(fā)現(xiàn)的甲型SIV有HINl、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等11種不同亞型。豬群中流行的SIV亞型主要有H1N1、H3N2和H1N2三

種。其中，H1N1病毒于1930年在美國首次分離出來。2009年3月在墨西哥、美國等地暴發(fā)的甲型H1N1流感病毒，是一種新型的變異病毒株，這種新型流感病毒具有病毒雜交特性，它包含人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒的基因片段，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征。因此，豬流感不僅給畜禽養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟損失，而且還對人類健康造成威脅，因此快速、敏感、準確診斷豬流感，具有重要的經(jīng)濟價值和公共衛(wèi)生意義。作為一種重要的人畜共患病，目前已有多種檢測和診斷方法用于SIV感染。

1 檢測樣品的采集

（1）用于直接檢測的樣品需要在SIV復制和向外排毒期間采集。通常是感染SIV后的1～8d?？贵w反應通常在感染的7～21d后能夠檢測到。一般在感染后2～4周后采集血清樣品用于檢測抗體。樣品應在采集后的48h內送至實驗室進行診斷。（2）采集豬的唾液以及鼻腔分泌物樣品對檢測豬流感病毒十分有用。由于唾液收集相對容易，對唾液樣本的檢測已成為重要的診斷篩查方法。唾液樣本的采集可以采用滅菌的棉簽，采集過程中避免有外來污染，如飼料，糞便和有機物質。（3）唾液樣品可能很難從新生仔豬中采集。斷乳仔豬，生長豬以及成年豬采集唾液樣本比較容易。唾液樣品的缺點是可能會存在影響RT-PCR檢測的抑制劑。此外，樣品中病毒含量較低有可能會影響到測序或病毒分離。鼻試子樣品用于測序或病毒分離由于唾液樣品，因為其樣品中的病毒含量較高。

2 病理學診斷

對因SIV感染而死亡的豬進行病理學診斷是一種重要的方法。病理學觀察所需的樣品包括使用福爾馬林固定的新鮮肺組織、氣管以及肺灌洗液。流感病毒感染的肺組織通常呈紫紅色。病理學觀察可以看到肺部的呼吸道(支氣管或細支氣管)上皮壞死。肉眼或顯微鏡下觀察到病變加上RT-PCR檢測呈陽性可以用作流感的確診。

3 實驗室診斷

3.1 電鏡技術 通過電鏡能夠觀察到病毒粒子。SIV病毒粒子呈橢圓形，棒狀和圓形，直徑約為80～120nm。雖然電鏡技術直接、客觀，但是對病毒滴度不僅要求高，設備昂貴，而且需要熟練的技術操作人員，因此，電鏡用于臨床檢測的價值較低。

3.2 病毒分離和鑒定 從待檢病料樣品中分離和培養(yǎng)SIV在檢測宿主范圍和致病機理的研究及疫苗生產(chǎn)等方面都很重要。豬流感病毒可在雞胚和培養(yǎng)細胞中增殖，由于雞胚中增殖敏感性高，通常被稱為豬流感診斷的“金標準”。但是病毒分離出來之后，還需要多種方法進一步鑒定確診。

3.3 血清學診斷 常規(guī)SIV的亞型鑒定最實用的確診方法是血清學診斷技術，即紅細胞凝集(HA)試驗、血凝抑制(HI)試驗、神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)試驗、中和試驗(SN)、瓊脂凝膠擴散試驗(AGID)、免疫熒光法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫過氧化酶單層細胞試驗(IPMA)、免疫組織化學(IHC)試驗。這些傳統(tǒng)的血清學診斷方法往往操作繁瑣，診斷時間長，結果重復性不好，限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應用。例如IHC是一種可用于診斷豬流感的檢測方法，但需要將臟器組織使用福爾馬林進行固定。IHC方法主要用于鑒定肺臟上的流感病毒抗原。但是福爾馬林固定以及臟器的選擇會影響到檢測的特異性和敏感性。

3.4 分子生物學診斷 傳統(tǒng)診斷方法在病毒的初次分離和亞型鑒定中仍然起著重要的作用。隨著分子生物學的發(fā)展，應用分子生物學診斷技術進行豬流感快速診斷和鑒定已成為國內外研究豬流感的重要手段之一。分子診斷技術具有特異性好、靈敏度高、針對性強、診斷快速等優(yōu)點。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)是實驗室檢測常用的分子生物學方法。檢測的樣品可以是唾液、鼻分泌物和肺組織等。RT-PCR可用來鑒定分離的病毒，也可直

接用于臨床病料的檢測，因此，RT-PCR能對SIV作出早期診斷。隨著RT-PC技術的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)能夠用于檢測不同流感病毒的亞型，即確定感染的病原是H1N1、H1N2、H3N2或其他亞型的流感病毒。實時熒光定量RTPCR的方法用于SIV的檢測也早有報道。

除此之外，其他的一些分子生物學診斷方法如依賴核酸序列的擴增法、核酸探針、基因芯片、蛋白質芯片、內源性病毒編碼酶檢測法等也都有用于SIV檢測的報道。這些技術在用于SIV方面各有特點和優(yōu)勢。例如，利用基因芯片技術能夠用來檢測1-16亞型的甲型流感病毒，并且還可以對當前流行的甲型H1N1流感病毒進行特異性檢測，還可以對H1，H3，H5，H7，H9亞型流感病毒進行分型檢測。

總之，隨著技術的進一步發(fā)展，將SIV的傳統(tǒng)診斷方法和現(xiàn)代的分子生物學診斷新技術有效地結合起來，不斷改進診斷方法和技術，這肯定能夠為防控豬流感提供必要的技術保障。

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2015–05–23）