王錢 馬敏敏 楊敏春 萬曉青

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)·杭州 310053）

梔子來源于茜草科植物梔子（Gaedenia jasminodies Eills）的干燥成熟果實(shí)。性喜溫暖濕潤(rùn)氣候，好陽光但又不能經(jīng)受強(qiáng)烈陽光照射，適宜生長(zhǎng)在疏松、肥沃、排水良好、輕粘性酸性土壤中，產(chǎn)于山東、江蘇、安徽、浙江等。性苦、寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒，外用消腫止痛的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：梔子具有解熱鎮(zhèn)靜、保肝利膽等功效，臨床上用于治療急性黃疸性肝炎、止痛、扭挫傷、冠心病[4]。在天然藥物化學(xué)成分的研究中，萜類成分一直是研究的熱點(diǎn)，亦是尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物生物活性成分的重要來源。環(huán)烯醚萜類成分屬于單萜類化合物，是蟻臭二醛的縮醛衍生物，是許多中藥的主要有效成分。環(huán)烯醚萜類成分廣泛存在于植物界，在玄參科、茜草科、唇形科、龍膽科、馬鞭草科、木犀科等雙子葉植物中均有分布。本文對(duì)梔子中兩種環(huán)烯醚萜類成分京尼平龍膽雙糖苷和京尼平苷的提取分離鑒定進(jìn)行了研究，為梔子今后的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1000 高效液相色譜儀( 美國(guó)Agilent 公司) ，Sephadex LH-20 凝膠( 瑞士 Phar-macia 公司) ，Diaion HP20 樹脂( 德國(guó)化學(xué)公司)，ODS C18反相硅膠(美國(guó)化學(xué)公司) ，LC-9210NEXT型制備液相( 德國(guó)化學(xué)公司)，LGJ-10D 型冷凍干燥機(jī)( 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

梔子藥材購(gòu)于河南（鄭州保佰德生物科技有限公司）、江西（萍鄉(xiāng)市梔子花中藥材種植有限公司）、福建（福建省康寶梔子產(chǎn)業(yè)有限公司）、江蘇（江蘇淮陰醫(yī)藥有限公司）、安徽（安徽康之源藥業(yè)有限公司）、四川（四川碩康植物原料有限公司）等地，經(jīng)本校胡保國(guó)老師鑒定均是為茜草科植物梔子 Gardenia jasminoides的干燥成熟果實(shí)。

2 提取分離及鑒定

稱取干燥果實(shí)2kg，粉碎，以6倍量的60%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，即得梔子浸膏0.73kg。取上述浸膏200g，用適量水超聲溶解，裝于大孔樹脂柱子上，0.5bv水沖洗后用40%乙醇沖洗，將洗脫液干燥得富集物130g。稱取大孔樹脂分離的40%乙醇提取物1g，加入10%甲醇2ml，超聲并加熱溶解制成0.5g/ml的溶液，過0.22um微孔濾膜后，注入已平衡好的ODS柱上，用LC-9210NEXT型制備液相進(jìn)行分離，分離條件及洗脫條件見表1及表2。100-136min兩個(gè)峰純度達(dá)到95%以上，單獨(dú)收集得白色粉末并且分離的純品均能達(dá)到20mg以上，可以用于結(jié)構(gòu)鑒定及定量分析。

表1 制備液相條件

表2 梯度洗脫條件

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。1H-NMR（400MHz，DMSO-d6）給出了δ：7.46（1H，s，H-3），5.69（1H，s，br s，H-7），5.11（1H，d，J=5.6Hz，H-1），5.06（1H，d，J=7.6Hz，H-1′），3.66（3H，s，COOCH3）。根據(jù)糖端基質(zhì)子JH-H數(shù)值（J=7.6Hz，8Hz）判斷葡萄糖端基構(gòu)型為β型，鑒定為京尼平-1-β-龍膽雙糖苷。其信號(hào)歸屬如下：1H-NMR（400MHz，DMSO-d6）給出了δ：7.46（1H，s，H-3），5.69（1H，s，br s，H-7）,5.11（1H，d，J=5.6Hz，H-1），5.06（1H，d，J=7.6Hz，H-1′），4.85（1H，d，J=8.0Hz，H-1″），3.66（3H，s，COOCH3）。綜合上述分析，推出化合物可能為京尼平苷龍膽雙糖苷，將此化合物光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]京尼平龍膽雙糖苷(genipin-1-β-D-gentiobioside)光譜數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致。

化合物2：白色粉末（氯仿），薄層鑒識(shí)，紫外光下呈亮藍(lán)色熒光。mp163～164 ℃，EI-MS m/z：411[M＋Na]+（C17H26O10）其信號(hào)歸屬如下：1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6） δ：7.37（1H，s，C3-H），5.66（1H，br s，C7-H），5.28（1H，d，J=4.8 Hz，C1-H），3.65（3H，s，COOCH3），4.72（1H，d，J=5.2Hz，C1′ -H）。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）給出兩個(gè)烯氫質(zhì)子δ：7.46（1H，s），5.67（1H，br s），1個(gè)甲氧基δ：3.68（3H，s），據(jù)此推斷此化合物可能為環(huán)烯醚萜苷類化合物，將此化合物的光譜數(shù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道京尼平苷的數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定此化合物為京尼平苷（geniposide）。

4 含量測(cè)定

4.1 色譜條件

色譜柱為agilent TCC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A相）；乙腈（B相）； 柱溫40℃；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。，進(jìn)樣量5ul，京尼平龍膽雙糖苷和京尼平苷分離良好，見圖1。

圖1 梔子樣品高效液色譜圖

4.2 制備對(duì)照品溶液

精密稱2種對(duì)照品（純度均大于99%）適量，分別置于25mL 容量瓶中，配制60%甲醇并用其超聲溶解并定容，搖勻，即得。依次精密吸取對(duì)照品溶液適量至10mL量瓶中，60%甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為 0.1369，0.1275g/L的混合對(duì)照品溶液，放置于冰箱中，即得。

4.3 制備供試品溶液

稱取適量干燥梔子粉末約0.7g，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入配制好的60%甲醇30mL，封閉，稱量，超聲50min，取出放至室溫，60%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻后10000r·min－1離心30 min，上清液以0.45um微孔濾膜濾過，即得。

4.4 線性關(guān)系考察

精密取混合對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10ul，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得成分1線性關(guān)系Y=1.834*103X+0.367（r=0.9999）， 成 分2線 性 關(guān) 系Y=1.898*103X-3.798(r=0.9999)。說明兩成分與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

4.5 精密度測(cè)定

精密吸取4.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5μL，相同色譜條件下于2d和5d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果2個(gè)成分峰面積的精密度RSD分別為 0.11%，0.16%。

4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取本實(shí)驗(yàn)同一批梔子藥材粉末8份，按上述方法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果成分 1 和 2 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.96，2.47 mg·g－1，RSD依次為1.5%，1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于制備后 0，3，6，9，12，18 ，24h 按上述方法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果成分1和2峰面積的RSD分別為0.68%，0.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.8 加樣回收率試驗(yàn)

取本實(shí)驗(yàn)已知含量樣品粉末8份，每份約 0.30 g，精密稱取，在藥材中加入等量對(duì)照品按上述方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，成分1和2的平均回收率為100%，100%，RSD分別為0.28%，0.42%，結(jié)果見表3。

4.9 不同產(chǎn)地梔子含量測(cè)定

取6個(gè)產(chǎn)地梔子樣品，按上述方法測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表4。

表3 梔子中兩成分加樣回收率測(cè)定

表4 不同產(chǎn)地梔子中兩成分含量測(cè)定

5 討論

環(huán)烯醚萜類成分一般采用溶劑法提取，常選用的提取溶劑為水、甲醇、乙醇、丙酮等溶劑，洗脫溶劑也主要是甲醇、水、乙腈。所以在分離過程中，需要低溫，分離的餾分盡量冷藏保存，以防止酶和有機(jī)酸的影響導(dǎo)致環(huán)烯醚萜類變色，環(huán)烯醚萜類成分性質(zhì)并不穩(wěn)定，變色意味著成分改變，很難逆轉(zhuǎn)，所以要謹(jǐn)防分離過程中成分變化。

京尼平龍膽雙糖苷和京尼平苷屬于環(huán)烯醚萜類成分，本實(shí)驗(yàn)采用方法能夠快速、方便的分離純化梔子中京尼平龍膽雙糖苷和京尼平苷兩種成分，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地梔子中兩類成分含量有一定差別，河南、江西產(chǎn)含量稍微高一些，本實(shí)驗(yàn)為今后梔子中環(huán)烯醚萜類成分的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)藥典一部，[M]．中國(guó)醫(yī)藥出版社，2010,231.

[2]苗明三,李振國(guó)．現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)[M]．北京: 人民衛(wèi)生出版社,2000: 708.

[3]孟祥樂,李紅偉,李顏，等.梔子化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]．中國(guó)新藥雜志,2011,20 (11) :959-967．

[4]Peng J,Qian ZY,Liu TZ,et al.Comparative studies on hepatic protective and choleretic effectof geniposide and crocetin.Chin J ofChin Mat Med,2003(2):105-108.

[5]Endo T,Taguchi H,A new iridoid glycoside from jasminoides Genipin-1-O-β-gentiobioside [J]. Chen Pharm Bull,1970,18:1065.

[6]Leticia J.Naggar I.Beal J L,et al.Iridoids A review [J].J Nat Prod,1980，43：649.