孟慶煥 祖元剛 王化

(森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040) (黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所)

王洪政 路祺 李平 吳薇薇 鐘晨 段喜華

(森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))) (哈爾濱市第三中學(xué)) (森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

2011 年，牡丹籽油被原衛(wèi)生部列為新資源食品［1-2］。牡丹種皮是在牡丹籽油生產(chǎn)過程中的廢棄物，一般作為垃圾直接丟棄，這樣不僅影響環(huán)境衛(wèi)生，也會造成自然資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，直接影響牡丹籽的高值化利用。前期研究發(fā)現(xiàn)牡丹種皮中含有黃酮類化合物，并且具有良好的清除自由基作用［3-5］。進(jìn)一步對牡丹種皮黃酮類化合物進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)了一種重要的活性成分——木犀草素。木犀草素具有抑菌、抗氧化、降血脂、降血壓、抗腫瘤等多種生物活性，臨床常用于止咳、祛痰、消炎等［6-7］。目前對于木犀草素的提取方法主要采用熱回流萃取法、微波輔助法、超聲波輔助法等這些方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)［8-9］。但針對提取木犀草素的原料牡丹種皮來說若使用上述方法，存在一個(gè)共同缺點(diǎn)，即粉碎牡丹種皮過程中產(chǎn)生大量粉塵，會嚴(yán)重影響操作人員的身體健康。所以本研究采用生物酶輔助乙醇勻漿法優(yōu)化木犀草素提取工藝，一方面可以直接將物料置于勻漿機(jī)中，與提取溶劑在勻漿裝置中混合均勻，通過機(jī)械及溶液之間的力的剪切作用將物料撕碎，使物料破碎和有效成分的提取同步進(jìn)行，達(dá)到種皮中目的活性物質(zhì)快速和強(qiáng)化提取。另一方面，生物酶可以將細(xì)胞壁的組成成分水解或是降解，破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸于溶劑中，從而達(dá)到提高木犀草素提取率的目的［10-11］。目前該方法在國內(nèi)外關(guān)于木犀草素的提取研究方面未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以木犀草素的提取率為參考指標(biāo)，探求酶法輔助乙醇提取木犀草素的最佳工藝條件，為牡丹種皮中的木犀草素提取提供一種新的高效的工藝方法。

1 材料與方法

1．1 材料

牡丹成熟干燥的種子，經(jīng)脫殼機(jī)去皮，收集種皮洗凈后于干燥箱中60 ℃烘干過夜，粉碎過40 目篩備用。木犀草素對照品(中國藥品生物制品鑒定所)、纖維素酶R-10(酶活力10 000 U/g，Amresco，美國)、果膠酶(酶活力500 U/mg，Amresco，美國)，甲醇為色譜純，超純水自制，其他試劑均為分析純。

717 型自動進(jìn)樣高效液相色譜儀，包括1525 二元泵和2487 型紫外光檢測器(美國WATERS 公司);Mill-Q 去離子水制備系統(tǒng)(美國Millipore 公司);美國迪馬色譜柱(4．6 mm×250 mm，5 μm);3K-30 超速離心機(jī)(美國Sigma 公司)。

1．2 方法

1．2．1 HPLC 測定條件

HPLC 液相條件。色譜柱:Diamonsil C18(250 mm×4．6 mm，5 μm);流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。流動相為V(甲醇)∶V(0．4%磷酸水溶液)=52 ∶48;檢測波長360 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。配制標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取木犀草素對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，使之成為質(zhì)量濃度1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再依次稀釋成0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25 g·L-1不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。每樣重復(fù)3 次，峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木犀草素對照品回歸方程y=38 813 650．58x+92 733．00(R2=0．999)，表明木犀草素在0．031 25 ～0．5 g·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

1．2．2 乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的篩選，準(zhǔn)確稱取5．00 g牡丹種皮，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL混合均勻后，勻漿3 min 提取一次的條件下，用體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、60%、70%、80%和95%乙醇溶液提取牡丹種皮中木犀草素，比較提取率差異，討論乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取率的影響。

料液比的篩選，準(zhǔn)確稱取5．00 g 牡丹種皮，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，勻漿，混合均勻后，勻漿3 min 提取一次的條件下，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)為1 g ∶6 mL、1 g ∶8 mL、1 g ∶10 mL、1 g ∶12 mL、1 g ∶15 mL 和1 g ∶20 mL，提取牡丹種皮中木犀草素，比較提取率的差異，討論牡丹種皮樣品與乙醇溶液的料液比對提取率的影響。

勻漿時(shí)間的篩選，準(zhǔn)確稱取5．00 g 牡丹種皮，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL 加入80%乙醇溶液，勻漿一次，提取時(shí)間分別為1、2、3、4、6 和8 min，提取牡丹種皮中木犀草素，比較提取率，討論勻漿時(shí)間對提取率的影響。

提取次數(shù)的篩選，準(zhǔn)確稱取5．00 g 牡丹種皮，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL 加入乙醇溶液，混合均勻后，勻漿6 min，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液提取牡丹種皮中木犀草素，提取次數(shù)分別設(shè)為1、2、3 和4 次，比較提取率差異，討論勻漿提取次數(shù)對牡丹種皮中木犀草素提取率的影響。

1．2．3 酶解處理單因素實(shí)驗(yàn)

纖維素酶和果膠酶種類和質(zhì)量濃度的篩選。準(zhǔn)確稱取7 份1 g 牡丹種皮，在45 ℃、pH 值4．5 和孵育180 min 條件下進(jìn)行酶解，每份牡丹種皮中加入HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，分別為0．1 g·L-1纖維素酶、0．2 g·L-1纖維素酶、0．3 g·L-1纖維素酶、0．5 g·L-1纖維素酶、0．01 g·L-1果膠酶、0．05 g·L-1果膠酶和0．1 g·L-1果膠酶。取出后在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進(jìn)行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

孵育時(shí)間的篩選。準(zhǔn)確稱取1 g 牡丹種皮4份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，在45 ℃、pH 值4．5 條件下進(jìn)行酶解，酶解孵育時(shí)間分別為90、120、150、180 min。取出后在90℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進(jìn)行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

孵育溫度的篩選。準(zhǔn)確稱取1 g 牡丹種皮4份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，在pH 值4．5、時(shí)間150 min 條件下進(jìn)行酶解、溫度分別為40、45、50、55 ℃。取出后在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進(jìn)行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

孵育pH 的篩選。準(zhǔn)確稱取1 g 牡丹種皮4 份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，在溫度為45 ℃、時(shí)間150 min 條件下進(jìn)行酶解，pH 值分別為3．5、4．0、4．5 和5．0。取出后在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進(jìn)行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

1．2．4 樣品測定溶液制備

將所得牡丹種皮木犀草素提取液，放入1．5 mL離心管中，置于離心機(jī)10 000 r·min-1離心10 min后，按照上述HPLC 液相條件，測定木犀草素提取率。

2 結(jié)果與分析

2．1 乙醇提取單因素實(shí)驗(yàn)

由表1 可以看出:隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，木犀草素的提取率也增加，在達(dá)到80%時(shí)，提取率最高;此后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，提取率反而下降。而隨著料液比增加、勻漿時(shí)間延長和提取次數(shù)的增多，木犀草素提取率呈現(xiàn)先增加后基本保持平穩(wěn)的趨勢。

2．2 乙醇提取木犀草素正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照盡量減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)和尋求設(shè)計(jì)最優(yōu)的原則，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、勻漿時(shí)間和提取次數(shù)作為因素，每個(gè)因素各取3 水平。正交試驗(yàn)方案(L9(34))及結(jié)果見表2 和表3。

表1 乙醇提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 乙醇提取木犀草素正交試驗(yàn)因素水平

表3 乙醇提取木犀草素正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 極差分析結(jié)果可以看出，對木犀草素提取率影響最大的是乙醇體積分?jǐn)?shù)，影響最少的因素是勻漿時(shí)間，各因素影響的主次順序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)、勻漿時(shí)間。由k 值可以得到最佳組合:A2B2C1D2，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL、勻漿時(shí)間為4 min和提取2 次。在最優(yōu)乙醇提取條件下，經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可得木犀草素最高提取率為0．754 mg·g-1。

2．3 酶解輔助乙醇提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

由表4 所示，經(jīng)過酶解孵育后，牡丹種皮中木犀草素提取率呈顯著增加趨勢。木犀草素提取率在0．1 g·L-1纖維素酶孵育后增加緩慢，在0．05、0．1 g·L-1的果膠酶孵育后的牡丹種皮中木犀草素提取率增加明顯。隨著酶孵育時(shí)間的延長，木犀草素提取率呈增加趨勢;而隨著孵育溫度和孵育pH 值升高，木犀草素提取率出現(xiàn)了拐點(diǎn)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取有意義的水平進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。選擇纖維素酶0．5 g·L-1、果膠酶0．05、0．1 g·L-1，孵育時(shí)間120、150、180 min，孵育溫度40、45、50 ℃，孵育pH 值4、4．5、5，進(jìn)行下一步的正交試驗(yàn)。

表4 酶解輔助乙醇提取工藝單因素結(jié)果

2．4 酶輔助乙醇提取木犀草素優(yōu)化工藝

在前期乙醇勻漿優(yōu)化工藝參數(shù)和酶解輔助提取單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對酶解輔助乙醇提取木犀草素工藝進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化(L9(34))，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5 和表6。

表5 酶輔助乙醇提取木犀草素正交試驗(yàn)因素和水平

影響木犀草素提取率的各因素主次順序是:酶液質(zhì)量濃度、孵育溫度、孵育時(shí)間、孵育pH 值。由極差分析得最佳條件組合為:A2B3C2D2，即果膠酶質(zhì)量濃度為0．05 g·L-1，酶解孵育時(shí)間為180 min，孵育溫度45 ℃、孵育pH 值為4．5。

表6 酶解輔助乙醇提取木犀草素正交試驗(yàn)結(jié)果

2．5 最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對正交試驗(yàn)中酶解輔助乙醇勻漿提取木犀草素的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確稱取1 g 牡丹種皮3 份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc酶緩沖液2 mL，在溫度為45 ℃、pH 值4．5 條件下進(jìn)行酶解孵育180 min。在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 勻漿4 min，提取2 次，測定牡丹種皮中木犀草素提取率平均值為3．241 mg·g-1，均高于單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，表明此工藝可以有效提高牡丹種皮中木犀草素的提取率。

3 結(jié)束語

復(fù)合酶解輔助乙醇提取木犀草素的工藝參數(shù)為:酶解孵育溫度45 ℃、果膠酶0．05 g·L-1、酶解孵育時(shí)間180 min、酶解孵育pH 值4．5、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL、勻漿時(shí)間4 min、提取2 次，在此最優(yōu)條件下所得木犀草素提取率為3．241 mg·g-1，相較于乙醇提取法所得木犀草素提取率0．754 mg·g-1，升高4．3 倍。

經(jīng)過酶孵育處理的牡丹種皮中木犀草素提取率顯著提高，并且果膠酶處理后所得木犀草素提取率高于纖維素酶，這與牡丹種皮的物質(zhì)組成有密切關(guān)系。纖維素酶主要是降解細(xì)胞壁中的纖維素，而果膠酶主要是降解細(xì)胞壁和胞間質(zhì)中的果膠。通過本實(shí)驗(yàn)分析推斷，牡丹種皮中果膠的含量比較高，因此使用果膠酶可以使牡丹種皮中的有效成分充分溶出，達(dá)到強(qiáng)化提取的作用，最終獲得了一種提取木犀草素的最佳工藝。

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