張郢峰，趙月然

(1.陜西國(guó)防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710302;2.大連市藥品檢驗(yàn)所，遼寧 大連 116021)

魚(yú)油中富含有多種不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸，其主要功能性成分是被人們譽(yù)為“腦黃金”的ω-3 系多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Arid，簡(jiǎn)稱EDA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，簡(jiǎn)稱DHA)［1］。

80 年代的實(shí)驗(yàn)和臨床研究［2］表明，EPA 和DHA 能有效地降低血脂和血壓水平［3］，抑制血小板聚集［4-5］，增加血漿纖溶活性，改變血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的前列腺素代謝途徑，對(duì)防治心肌梗塞有一定的效果［6］，另外它們能降低人紅細(xì)胞丙二醛水平，增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性，調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化能力，可能具有潛在的抗衰老作用［7］。

魚(yú)油保健品中的EPA 和DHA 一般都以乙酯形式存在，近年來(lái)，魚(yú)油制品已作為保健營(yíng)養(yǎng)食品出現(xiàn)，因此建立一種便捷、可靠的方法來(lái)監(jiān)控魚(yú)油保健品的質(zhì)量十分必要。目前，EPA 和DHA 的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜法(GC)［8］。HPLC 檢測(cè)脂肪酸類化合物一般采用正相色譜，溶劑耗費(fèi)大，且靈敏度不高。GC 檢測(cè)脂肪酸類化合物具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、速度快、溶劑耗費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)，是脂肪酸類化合物定量分析的首選方法。本實(shí)驗(yàn)建立了GC 定量法快速測(cè)定魚(yú)油產(chǎn)品中EPA 和DHA 的檢測(cè)方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。為目前魚(yú)油保健品的質(zhì)量監(jiān)控提供了一種快速可靠的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

正己烷，色譜純;二十碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(含量＞99%，U-99M-J10-V)、二十二碳六烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(含量＞99%，U-84M-A11-W)均來(lái)自美國(guó)NUChek Prep 公司;市售魚(yú)油11 種。

7890A 氣相色譜儀;BP211D 型、BP221S 型電子分析天平。

1.2 色譜條件

色譜柱DB-5MS(0.32 mm×30 m)，載氣為N2，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速300 mL/min。

程序升溫初始210 ℃，1 ℃/min 升至240 ℃，10 ℃/min 升至300 ℃，分流比10 ∶1。

1.3 供試品溶液的制備

取供試品10 粒，取出內(nèi)容物混勻，精密稱取0.20 ～0.30 g，置25 mL 量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，精密稱取2 mL，置于10 mL 具塞試管中，加入2 mol/L 氫氧化鈉-甲醇溶液1 mL，充分振蕩10 min，于60 ℃的水浴中加熱2 min，進(jìn)行皂化反應(yīng)，冷卻至室溫，加入2 mol/L 鹽酸-甲醇溶液2 mL，充分振蕩10 min，并于50 ℃的水浴中加熱2 min，進(jìn)行甲酯化，后棄去下層溶液，再加2 mL 純化水洗凈，并棄去水層，移出正己烷層，至另一裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗中脫水后，即得。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品二十碳五烯酸甲酯(以下簡(jiǎn)稱EPA 甲酯)，置量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得EPA 甲酯儲(chǔ)備液。濃度為1.000 8 mg/mL。EPA 結(jié)果換算系數(shù)為0.955 7。

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品二十二碳六烯酸甲酯(以下簡(jiǎn)稱DHA 甲酯)，置量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得DHA 甲酯儲(chǔ)備液。濃度為1.001 2 mg/mL。DHA 結(jié)果換算系數(shù)為0.959 0。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液及DHA 甲酯儲(chǔ)備液各0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分析

色譜分析見(jiàn)圖1。

圖1 色譜分析圖Fig.1 Chromatogram analysis chart

由圖1 可知，圖1A 為對(duì)照品EPA 甲酯色譜圖，圖1B 為對(duì)照品DHA 甲酯色譜圖，樣品中EPA 甲酯和DHA 甲酯色譜峰與對(duì)照品一致，并與其他色譜峰與分離度＞3，說(shuō)明該氣相色譜條件較為合適。

2.2 線性關(guān)系的考察

分別精密量取1.4 節(jié)下混合對(duì)照品溶液1 μL注入氣相色譜儀測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到EPA 的回歸方程為y=924.79x +20.687，R2=0.999;同法得DHA 的回歸方程為y=1 025x+2.791 5，R2=0.999。線性范圍分別為0.05 ～1.00 mg/mL 和0.05 ～1.00 mg/mL。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取魚(yú)油(樣品6)約0.20 g，精密稱定。按1.3節(jié)下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得EPA 甲酯、DHA 甲酯的RSD值分別為1.6%，0.9%。結(jié)果表明，儀器精密度較好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取魚(yú)油(樣品6)6 份，每份約0.20 g，精密稱定。按1.3 節(jié)下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得EPA 甲酯RSD 值分別為1.1%，DHA 甲酯RSD 值1.5%，結(jié)果表明，儀器重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液(樣品6)，在室溫下放置，分別在0，2，4，6，8，12，24 h 進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。EPA、DHA 甲 酯 峰 面 積 的RSD 分 別 為1.6%，1.9%。結(jié)果表明，2 種化合物在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含有量的魚(yú)油(樣品6)6 份，每份約0.20 g，精密稱定。分別準(zhǔn)確加入EPA、DHA 甲酯對(duì)照品貯備液各5 mL。按1.3 節(jié)下供試品溶液制備的方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率為98.9%，97.8%。

2.7 含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法測(cè)定魚(yú)油膠囊中的EPA 及DHA 含量，共測(cè)定11 種市售魚(yú)油產(chǎn)品，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 市售魚(yú)油產(chǎn)品DHA 及EPA 含量Table 1 Content of EPA and DHA in commercially available fish oil

由表1 可知，測(cè)得魚(yú)油中的EPA 及DHA 市售11 種產(chǎn)品中的含量與標(biāo)示量相比，均小于標(biāo)示含量，尤其是樣品4 和樣品7，幾乎不含有EPA 及DHA。

3 結(jié)論

通常的甲酯化方法有酸法甲酯化、堿法甲酯化和三甲基硅重氮甲烷甲酯化等［9-10］。堿法甲酯化存在酯化不完全的缺點(diǎn);三甲基硅重氮甲烷甲酯化法對(duì)于游離脂肪酸甲酯化程度較好;本方法參考GB/T 5009.168—2003 酸法甲酯化法，具有甲酯化程度高的優(yōu)點(diǎn)。

本方法采用的GB/T 5009.168—2003 酸法甲酯化法進(jìn)行測(cè)定［11-12］，但是由于市售商品均為乙酯化產(chǎn)品，因此還需要建立測(cè)定乙酯化魚(yú)油產(chǎn)品的方法使測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。需要建立合理的、科學(xué)的魚(yú)油含量的測(cè)定方法，保證市售魚(yú)油產(chǎn)品的質(zhì)量可控，產(chǎn)品的質(zhì)量的穩(wěn)定，以及規(guī)范保健食品的標(biāo)示含量以免誤導(dǎo)消費(fèi)者。

［1］ Dyerhery J，Bang H.Eicosapentaenoic acid and prevention of thrombosis and atherosclerosis［J］.Lancet，1979，2:117-119.

［2］ 劉兆平，吳葆杰.二十碳五烯酸的代謝和生理作用［J］.海洋藥物，1984，4(12):9-14.

［3］ Mclntosh G H，Melennan P L.The influence of dietary fats on plasma lipids，blood pressure and coagulation indices in the rat［J］.Atherosclerosis，1985，55:125-134.

［4］ 王建中，朱瑞龍，張國(guó)楨，等.魚(yú)油多不飽和脂肪酸抗血栓的研究［J］.醫(yī)藥工業(yè)，1988，19(3):109-111.

［5］ Goodnight SHLY，Williom.The effects of dietary ω-3 fatty acids on platelets composition and function in man.A prospective，controlled study［J］.Blood，1981，58:880-885.

［6］ Saynor R，Verel D.The long-term effect of dietary supplementation with fish lipid concentrate on serum lipids.Bleeding time，platelets and angina［J］.Atherosclerosis，1984，50:3-10.

［7］ 王建中，朱瑞龍，邱仁芳，等.魚(yú)油多不飽和脂肪酸對(duì)人血小板紅細(xì)胞必需脂肪酸的組成以及過(guò)氧化-抗氧化能力的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1992，23(2):74-77.

［8］ 王娟娟，許晨，許建中，等.乙酯型魚(yú)油中二十碳五烯酸乙醋和二十二碳六烯酸乙醋的定量檢測(cè)［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2012，24:49-53.

［9］ 范亞葦，鄧澤元，余永紅.不同脂肪酸甲酯化方法對(duì)共軛亞油酸分析的影響［J］.中國(guó)油脂，2007，32(1):52-55.

［10］ 李慶民，陳桂范，高實(shí).氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定魚(yú)油中EPA 和DHA 的含量［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，13(4):259-261.

［11］朱亞爾，李士敏.魚(yú)油微丸中EPA-E 和DHA-E 的含量測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32(1):24-25.

［12］ Niessen WMA.Advances in instrumentation in liquid chromatography-mass spectrometry and related liquid-introduction techniques［J］.J Chromatogr A，1998，794(1/2):407-412.