張劍虹 張飛 張曉麗 劉博 劉君超

乙狀結(jié)腸黏液腺癌發(fā)病率逐年升高，預(yù)后差，化療作為一種綜合治療手段，廣泛應(yīng)用于臨床，但腫瘤細(xì)胞耐藥是化療失敗的重要原因，腫瘤 細(xì) 胞 的 多 藥 耐藥(mutidrug resistance，MDR)機(jī)制的存在可造成化療的失敗，MDR已是當(dāng)前乙狀結(jié)腸黏液腺癌化療過程必須關(guān)注的問題。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，耐藥基因及其產(chǎn)物的檢測為化療方案的選擇提供了科學(xué)有力的依據(jù)。本研究通過檢測MDR1/P-gp在乙狀結(jié)腸黏液腺癌中表達(dá)情況，同時分析MDR1/P-gp與CerbB-2在乙狀結(jié)腸黏液腺癌治療及預(yù)后的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科2008至2013年手術(shù)切除乙狀結(jié)腸黏液腺癌存檔蠟塊86例，臨床資料完整，年齡28～62歲，平均年齡45歲，術(shù)前均未接受化療、放療及內(nèi)分泌治療。乙狀結(jié)腸黏液腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)按WHO腸道腫瘤組織學(xué)分型進(jìn)行，所有樣本切片均兩位有經(jīng)驗高年資病理醫(yī)師證實(shí)為黏液腺癌。乙狀結(jié)腸黏液腺癌按臨床TNM分期分Ⅲ期，Ⅰ期26例、Ⅱ期39例、Ⅲ期21例;腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例、無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例;≤4 cm的腫瘤37例、＞4 cm腫瘤49例。所有患者均為首次發(fā)病，無腸癌家族遺傳史。

1.2 組織芯片制備 組織芯片委托試劑公司在天津腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所完成，過程如下:組織載玻片經(jīng)過夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚賴氨酸行防脫片處理，對每一組織標(biāo)本，觀察HE切片，選取目標(biāo)組織并在HE切片及其相應(yīng)石蠟組織塊(供體蠟塊)上標(biāo)記，萊卡石蠟空白蠟塊(受體蠟塊)與蜂蠟混合(比例為1∶1)，制成2.2 cm ×3.5 cm ×1 cm 大小蠟塊，用加拿大生產(chǎn)CDX718組織芯片儀打孔制成帶孔空白蠟塊，將蠟塊放在39～42℃水浴中軟化后，用組織芯片儀從供體蠟塊標(biāo)記部位逐個取出直徑1 mm高4 mm的組織柱，推入空白蠟塊預(yù)先設(shè)計的相應(yīng)孔內(nèi)，這樣在空白蠟塊上制作完成了68個組織芯片，為防止染色過程中脫片，每例標(biāo)本上樣四個點(diǎn)，分別安插在空白蠟塊1和2中，對蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，裱于防脫片處理的載玻片上。見圖1。

圖1 組織芯片蠟塊

1.3 免疫組織化學(xué)方法 MDR1/P-gp、CerbB-2單克隆抗體及SP法免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物試劑有限公司，組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，光鏡分期，采用S-P法，進(jìn)行免疫組化染色，主要免疫組織化學(xué)步驟:石蠟包埋組織切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫室溫下10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;充分水洗，與pH值6.0的檸檬酸緩沖液中高壓鍋處理10 min后，室溫冷卻;非免疫羊血清封閉 10 min后，加入即用型鼠單抗 MDR1/P-gp、CerbB-2，4℃冰箱過夜，再加入生物素化羊抗鼠IgG和S-P復(fù)合物。以DAB液顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。用TBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) 陽性結(jié)果判斷根據(jù)以下兩方面的總分進(jìn)行判斷:(1)選染色均勻的陽性表達(dá)區(qū)域，5個高倍視野計數(shù)陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞所占百分比為5級計分:陽性細(xì)胞率＜5%為0分;陽性細(xì)胞率5% ～25%為1分;陽性細(xì)胞率26% ～50%為2分;陽性細(xì)胞率51% ～75%為3分，陽性細(xì)胞率＞75%為4分。(2)按染色強(qiáng)度來分:不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩種評分相加，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)，以上方法均由2名有經(jīng)驗的高年資病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立檢測，取平均值。CerbB-2的陽性表達(dá)以細(xì)胞膜出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性，MDR1/P-gp以細(xì)胞漿內(nèi)有棕色顆粒著色者為陽性。高倍鏡下計數(shù)10個高倍視野，陽性細(xì)胞記數(shù)＞10%，判定為陽性。陽性細(xì)胞記數(shù)＜10%，判定為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較，采用χ2檢驗和線性相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織染色 乙狀結(jié)腸經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為黏液腺癌，黏液位于腺上皮細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外。CerbB-2在乙狀結(jié)腸黏液腺癌中的表達(dá)，分布特點(diǎn):CerbB-2陽性細(xì)胞可見細(xì)胞膜呈完整或不完整淺-棕黃色顆粒，密度不均勻，與血管走行無規(guī)律性。MDR1/P-gp在乙狀結(jié)腸黏液腺癌中的表達(dá)分布特點(diǎn):MDR1/P-gp陽性細(xì)胞可見細(xì)胞漿內(nèi)呈淺-棕黃色顆粒，密度分布較均勻，與血管走行無規(guī)律性。見圖2～5。

圖2 乙狀結(jié)腸黏液腺癌(HE×400)

圖3 乙狀結(jié)腸黏液腺癌(HE×400)

圖4 CerbB-2在乙狀結(jié)腸黏液腺癌中表達(dá)，細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒(SP×400)

圖5 MDR1/P-gp在乙狀結(jié)腸黏液腺癌的表達(dá)，細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒(SP×400)

2.2 乙狀結(jié)腸黏液腺癌CerbB-2與MDR1/P-gp表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系 CerbB-2在臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的陽性表達(dá)率分別為 42.30%、38.46%、76.19%，Ⅰ、Ⅱ期相比無明顯差異，臨床Ⅲ期和Ⅰ、Ⅱ期比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，顯示臨床分期越高，CerbB-2陽性表達(dá)率越高。CerbB-2在有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率為65.71%，在無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率為37.25%，有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CerbB-2的陽性表達(dá)明顯高于無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。CerbB-2的表達(dá)與腫瘤大小無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。MDR1/P-gp在有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為62.85%，在無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率為29.41%，有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MDR1/P-gp的陽性表達(dá)明顯高于無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。MDR1/P-gp陽性表達(dá)率與乙狀結(jié)腸黏液腺癌的臨床分期，腫瘤大小無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。見表1。

表1 乙狀結(jié)腸黏液腺癌CerbB-2與MDR1/P-gp表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 例(%)

2.3 CerbB-2與MDR1/P-gp表達(dá)的關(guān)系 37例乙狀結(jié)腸黏液腺癌MDR1/P-gp表達(dá)陽性患者中，CerbB-2同時表達(dá)陽性者占72.97%(27/37)，CerbB-2表達(dá)陰性者占54.05%(20/37)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);MDR1/P-gp表達(dá)陰性者，其CerbB-2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CerbB-2與MDR1/P-gp的陽性表達(dá)具有一定正相關(guān)性。見表2。

表2 CerbB-2表達(dá)與MDR1/P-gp蛋白表達(dá)的關(guān)系 例(%)

3 討論

乙狀結(jié)腸黏液腺癌患者的預(yù)后取決于腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)特性，以及對化療藥物的敏感程度，研究不同個體乙狀結(jié)腸黏液腺癌細(xì)胞多藥耐藥基因蛋白MDR1/P-gp、癌基因標(biāo)志物CerbB-2的表達(dá)，可推測腫瘤細(xì)胞惡性程度、局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，研究最有效的個體化療方案，提高患者的生存率及預(yù)后水平。

P-gp是MDR1的表達(dá)產(chǎn)物，是由1280個氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白［1］，在 ATP的參與下P-gp發(fā)生能量依賴性變構(gòu)，通過激活A(yù)TP泵，將多種抗生素類和植物類化療藥物(如多柔比星、長春新堿類、紫杉醇等)排出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積濃度下降，藥物作用降低或完全喪失，從而阻斷化療藥物作用的發(fā)揮，細(xì)胞產(chǎn)生耐藥［2］。這種藥物外排機(jī)制稱為經(jīng)典的 MDR機(jī)制。P-gp表達(dá)水平與耐藥程度成正相關(guān)［3］。MDR1/P-gp在正常肝膽管、胰管、胃腸、腎、腎上腺等具有分泌排泄功能的細(xì)胞有表達(dá)［4］，起著清除毒性化合物的功能。乳腺癌、胃癌、肺癌等亦有較高表達(dá)。有研究表明，P-gp高表達(dá)與乳腺癌腫瘤侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)并與CerbB-2表達(dá)呈正相關(guān);P-gp陽性表達(dá)與直腸癌病理分期和遠(yuǎn)期生存率有關(guān)［2］。本實(shí)驗采用免疫組化法，檢測86例乙狀結(jié)腸黏液腺癌MDR1/P-gp蛋白表達(dá)水平，其 MDR1/P-gp陽性表達(dá)率為43.02%(37/86)，同時發(fā)現(xiàn)MDR1/P-gp表達(dá)與患者臨床分期無明顯相關(guān)性，而與腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者更容易發(fā)生MDR，據(jù)隨訪資料MDR1/P-gp陽性表達(dá)者術(shù)后5年生存率低于陰性表達(dá)者，提示MDR1/P-gp是影響乙狀結(jié)腸黏液腺癌患者預(yù)后的因素之一，推測其與化療敏感性及療效有關(guān)。本次研究采用的乙狀結(jié)腸黏液腺癌標(biāo)本術(shù)前均未接受化療，表明MDR1/P-gp參與介導(dǎo)的乙狀結(jié)腸黏液腺癌耐藥可能是原發(fā)性耐藥。

CerbB-2基因是乙狀結(jié)腸黏液腺癌最主要的癌基因標(biāo)志物之一，又稱為HER-2，其編碼產(chǎn)生的CerbB-2蛋白是一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性［5］，CerbB-2基因主要在胚胎發(fā)育時表達(dá)，而在乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中存在CerbB-2基因異常表達(dá)，CerbB-2與表皮生長因子(EGFR)有著類似的結(jié)構(gòu)與功能［6］，當(dāng)細(xì)胞受到不良刺激導(dǎo)致CerbB-2基因激活，CerbB-2編碼蛋白增多及活性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡被抑制;酪氨酸激酶自磷酸化，信息通道打開激活細(xì)胞內(nèi)多種基因，使細(xì)胞增殖加快［7］;CerbB-2通過對 Bcl-2α、β整合蛋白和黏附分子的相互作用，破壞了機(jī)體反侵襲屏障，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移力增強(qiáng);CerbB-2對血管內(nèi)皮生長因子有上調(diào)作用，從而促進(jìn)瘤組織內(nèi)血管增生，加快腫瘤生長速度［8］。對于CerbB-2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的關(guān)系，國內(nèi)外報道不一，有的報道CerbB-2蛋白在結(jié)直腸癌的陽性表達(dá)率很低，并且CerbB-2的表達(dá)與結(jié)直腸癌Dukes分期、預(yù)后等均無相關(guān)性，不能反映侵襲、轉(zhuǎn)移情況［9］;有的報道CerbB-2蛋白陽性表達(dá)與Dukes分期相關(guān)，并能反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系［10］。本研究結(jié)果顯示，乙狀結(jié)腸黏液腺癌中CerbB-2陽性表達(dá)率為48.83%(42/86)，臨床Ⅲ期和Ⅰ、Ⅱ期比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，臨床分期越高，CerbB-2陽性表達(dá)率越高。有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CerbB-2的陽性表達(dá)明顯高于無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。CerbB-2陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，證實(shí)CerbB-2癌基因高表達(dá)，CerbB-2編碼蛋白活性增強(qiáng)，使癌細(xì)胞增殖加快，促進(jìn)瘤組織內(nèi)血管增生，使癌細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)，具有更高的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。本實(shí)驗表明CerbB-2的異常表達(dá)在乙狀結(jié)腸黏液腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要作用，提示CerbB-2可作為乙狀結(jié)腸黏液腺癌診斷的生物學(xué)參考指標(biāo)，部分CerbB-2呈高表達(dá)的患者，通過特效藥物阻斷癌細(xì)胞中CerbB-2基因表達(dá)而達(dá)到治療乙狀結(jié)腸黏液腺癌的目的。

本研究中MDR1/P-gp與CerbB-2基因的表達(dá)均與腫瘤大小無相關(guān)性，提示MDR1/P-gp與CerbB-2基因均影響了癌細(xì)胞本身的生物學(xué)特性，而與癌細(xì)胞的數(shù)量和體積無關(guān)。

本實(shí)驗MDR1/P-gp蛋白陽性表達(dá)組中，CerbB-2同時陽性表達(dá)率高于CerbB-2蛋白陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明MDR1/P-gp、CerbB-2基因共表達(dá)在乙狀結(jié)腸黏液腺癌是存在的，并且CerbB-2基因的表達(dá)與多藥耐藥的激活有關(guān)，CerbB-2過表達(dá)的乙狀結(jié)腸黏液腺癌患者發(fā)生多藥耐藥的可能性較大。近年來發(fā)現(xiàn)，MDR1與CerbB-2過表達(dá)在耐藥和轉(zhuǎn)移方面生物學(xué)特性相似。CerbB-2過表達(dá)是否上調(diào)MDR1/P-gp水平，MDR1/P-gp表達(dá)是否對CerbB-2的表達(dá)水平有正反饋?zhàn)饔?，二者在乙狀結(jié)腸黏液腺癌中的表達(dá)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

本研究結(jié)果顯示，乙狀結(jié)腸黏液腺癌中存在MDR1/P-gp與CerbB-2基因共表達(dá)，聯(lián)合檢測可為乙狀結(jié)腸黏液腺癌患者綜合治療方案的選擇提供重要的依據(jù)。

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