藺會(huì)蘭 孫曉慧 金立娟 劉俊霞 田碩 張藝瑋 鐔麗霞

卵巢功能是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育、形成可受精卵母細(xì)胞的能力。其反映了生育潛能，直接影響輔助生殖技術(shù)的結(jié)局。卵巢功能減退為婦科內(nèi)分泌疾病的常見多發(fā)病之一。大多數(shù)卵巢功能減退患者年齡小于40歲，并出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)，閉經(jīng)，不孕等癥狀，給她們的生活、工作帶來種種不便。因此尋找卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制，有助于早期診斷、早期治療。MicroRNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)約20個(gè)nt的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過抑制翻譯或促進(jìn)mRNA的降解對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等多個(gè)生物過程［1］。研究表明，miRNAs與小鼠卵母細(xì)胞的成熟與卵泡發(fā)育有關(guān)［1］。目前關(guān)于miRNA對(duì)卵巢功能減退的作用機(jī)制尚不十分清楚，有大量研究證實(shí)Mir-21與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。本文通過檢測(cè)卵巢功能減退患者與正常人外周血的Mir-21表達(dá)差異及顆粒細(xì)胞凋亡情況，探討Mir-21與卵巢功能的相關(guān)性，為研究卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年11月至2013年12月因不孕接受IVF-ET/ICSI治療的患者43例，納入標(biāo)準(zhǔn):年齡25～40歲，月經(jīng)周期25～35 d，B超檢查除外多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、子宮肌瘤、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等疾病，無發(fā)熱及炎癥疾病，除外甲狀腺疾病、腎上腺疾病及其他系統(tǒng)腫瘤等。患者知情同意。

1.2 研究方法及分組 所有研究對(duì)象于月經(jīng)第2～4天8∶00 ～10∶00，空腹收集外周血 5 ml于 EDTA 抗凝管，1 h之內(nèi)離心，2 500 r/min，10 min收集上清，置－20℃保存待測(cè)性激素。采用微粒子化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，批內(nèi)變異系數(shù)＜5.4%，批間變異系數(shù)＜10%。根據(jù)性激素結(jié)果分為:卵巢功能減退組(FSH＞10 U/L)20例和卵巢功能正常組(FSH＜8 U/L)23例。卵巢功能減退組血 FSH(12.1±0.9)U/L，卵巢功能正常組FSH 為(7.0±1.4)U/L，卵巢功能減退組 FSH 高于正常組(P＜0.05);卵巢功能減退組血 LH(5.2±2.0)U/L、卵巢功能正常組血 LH(4.4 ±2.4)U/L，2 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。卵巢功能減退組E2(155±50)pmol/ml、卵巢功能正常組 E2(192±43)pmol/ml，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);卵巢功能減退組 T(3.0±1.3)nmol/L、卵巢功能正常組T(2.8 ±1.2)nmol/L，2 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，卵巢功能減退組年齡(31±4)歲、卵巢功能正常組年齡(29±5)歲，2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 2組間基本情況比較±s

表2 2組間基本情況比較±s

注:與卵巢功能減退組比較，*P＜0.05

組別 卵巢功能減退組(n=20) 卵巢功能正常組(n=23)年齡(歲)31±4 29±5體重指數(shù)(kg/m2) 21±10 21±9不孕年限(年) 4.0 ±2.1 3.7 ±1.7 FSH(U/L) 12.1 ±0.9 7.0 ±1.4*LH(U/L) 5.2 ±2.0 4.4 ±2.4 E2(pmol/ml) 155±50 192±43 T(pmol/ml)3.0 ±1.3 2.8 ±1.2

1.3 總 RNA提取 于室溫下，取血漿500 μl，采用Virina RNA試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，利用異丙醇沉淀 RNA，以70%冷乙醇清洗沉淀。在空氣條件下等待沉淀干燥后，加入二乙基焦磷酸酰胺(DEPC)處理的三蒸水溶解 RNA。利用紫外分光光度計(jì)和甲醛瓊脂糖變性電泳對(duì)提取的總RNA進(jìn)行純度和含量鑒定。

1.4 miRNA 檢測(cè) (1)逆轉(zhuǎn)錄:反應(yīng)總體系 25 μl，包括:提取總 RNA 按 1∶1稀釋后 1 μl，逆轉(zhuǎn)錄引物 3 μl(引物序列見表1)，dNTP終濃度為0.5 mmol/L，DTT終濃 度 為 10 mmol/L，5 × 逆 轉(zhuǎn) 錄 Buffers 5 μl，M-MLV 200 U，加無菌 ddH2O 補(bǔ)足到25 μl，反應(yīng)條件為:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10倍稀釋后－20℃保存?zhèn)溆谩?2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè):反應(yīng)體系 20 μl，包括:cDNA 按 1∶1稀釋后取2 μl，2 × 定量 PCR 反應(yīng)預(yù)混液 10 μl，引物及探針1 μl，加水補(bǔ)足到 20 μl。循環(huán)條件為:95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所用引物和探針由上海Sangon公司提供。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析:本研究采用相對(duì)定量的方法(2-△△CT)對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析、比較。見表1。

表1 引物序列

1.5 顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)/基因重組人卵泡刺激素(rFSH)/人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)/人絨毛膜促性腺激素(HCG)超促排卵方案，根據(jù)患者的年齡、AFC及基礎(chǔ)血清FSH/LH/E2水平確定促性腺激素(Gn)起始劑量，同時(shí)超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，根據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整Gn用量。當(dāng)1個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑超過18 mm、2個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑超過17 mm、3個(gè)主導(dǎo)卵泡平均直徑超過16 mm時(shí)給予人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000或10 000 U肌內(nèi)注射，36 h后經(jīng)陰道超聲取卵，收集卵泡液，于室溫下置于無菌試管中，在1 500 r/min條件下離心20 min，取沉淀置50%Percoll液上，再在1 000 r/min條件下離心10 min，回收位于兩液體中間的顆粒細(xì)胞層。應(yīng)用熒光染料溶液hoechst 33258染色，熒光顯微鏡下觀察1 000個(gè)顆粒細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞為核破碎或破碎細(xì)胞液中包含破碎核。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中Mir-21表達(dá) Mir-21在卵巢功能減退組和正常組血漿中 2-ΔΔCt值分別是(0.7818 ± 0.0633)和(1.0000±0.0000)，2 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，卵巢功能減退組外周血中Mir-21表達(dá)低于對(duì)照組。見圖1。

圖1 2組real-time PCR檢測(cè)卵巢早衰患者和正常人外周血中Mir-2的表達(dá)

2.2 顆粒細(xì)胞凋亡率比較 顆粒細(xì)胞凋亡率卵巢功能減退組為(24±10)%，正常組為(17±8)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞凋亡率高于卵巢功能正常組。hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)卵巢功能減退組顆粒細(xì)胞亮染，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小不規(guī)則顆粒狀凋亡小體。見圖2、3。

圖2 2組顆粒細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 Hochest33342細(xì)胞染色檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡，短尾箭頭所示為凋亡細(xì)胞，長(zhǎng)尾箭頭所示為正常細(xì)胞

3 討論

卵巢功能減退為婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域常見病，以繼發(fā)性閉經(jīng)、低雌激素等為其特點(diǎn)，其嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。卵巢功能減退的具體發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚，尋找卵巢功能減退的發(fā)病機(jī)制對(duì)改善卵巢功能至關(guān)重要。卵泡的發(fā)育經(jīng)歷了始基卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡、排卵前卵泡。竇前卵泡的后期，顆粒細(xì)胞出現(xiàn)了FSH的受體，F(xiàn)SH誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞芳香化酶的合成，芳香化酶使顆粒細(xì)胞將雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?，竇卵泡期FSH受體大量合成，產(chǎn)生更多的雌激素，促使卵泡發(fā)育，優(yōu)勢(shì)卵泡形成。因此，顆粒細(xì)胞在卵泡的發(fā)育過程中起決定性的作用［2，3］。大量研究發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡與卵子閉鎖及卵巢功能減退關(guān)系密切，當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡達(dá)10%以上時(shí)該卵泡發(fā)生閉鎖，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育，影響卵巢功能［4］。誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡的確切分子機(jī)制仍然不清，可能是促卵泡生長(zhǎng)因子:FSH、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、Bcl-2等和誘導(dǎo)閉鎖因子:抑制素(Inhibin)，Bax，F(xiàn)as，腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和caspase等相互作用的結(jié)果［5］。體外培養(yǎng)卵丘復(fù)合物發(fā)現(xiàn)移除卵母細(xì)胞后，卵丘細(xì)胞的凋亡率增加，加入各種生長(zhǎng)因子后卵丘細(xì)胞凋亡率顯著降低，表明這些介質(zhì)促使卵母細(xì)胞生長(zhǎng)，影響卵巢卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的活性，對(duì)卵泡發(fā)育至關(guān)重要，同時(shí)這些介質(zhì)的表達(dá)受 miRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［6］。

MiRNAs是一類長(zhǎng)約20 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，自1993年第一個(gè)階段性調(diào)控胚胎后期發(fā)育的miRNAs(lin-4)被發(fā)現(xiàn)，由于其在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等起重要作用而備受關(guān)注。研究表明在細(xì)胞核中，聚合酶RNAⅡ識(shí)別并啟動(dòng)宿主基因組間隔區(qū)或內(nèi)含子區(qū)，轉(zhuǎn)錄形成一個(gè)較長(zhǎng)的初級(jí) miRNA(pri-miRNA)，其與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，被聚合酶RNAⅢ-Drosha酶裂解成一個(gè)長(zhǎng)約70個(gè)核苷酸有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，然后再經(jīng)過Exportin 5運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中，被另一RNAⅢ核酸內(nèi)切酶-Dicer加工成長(zhǎng)約21-nt雙鏈miRNA，即成熟的miRNAs，此雙鏈miRNAs隨后分離成兩條單鏈，其中一條退化，另一條鏈與蛋白形成一個(gè)大的蛋白復(fù)合物—沉默復(fù)合體(RISC)，整合到靶基因mRNA中發(fā)揮作用。miRNAs通過抑制翻譯或促進(jìn)mRNA的降解對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等［7］。

細(xì)胞凋亡是保持細(xì)胞增殖和死亡相平衡的一種機(jī)制。細(xì)胞凋亡途徑分為外源性誘導(dǎo)凋亡途徑和內(nèi)源性誘導(dǎo)凋亡途徑。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制可能與 caspases凋亡途徑有關(guān)［8］。Vital-Reyes等［9］首次報(bào)道人卵巢顆粒細(xì)胞表達(dá)caspase-8，說明caspase-8參與顆粒細(xì)胞凋亡過程。免疫組化法證明，正常小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中不表達(dá)caspases-3，但在缺乏促性腺激素環(huán)境而誘導(dǎo)凋亡的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中caspases-3卻有表達(dá)。說明caspases-3參與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者認(rèn)為miRNAs可能通過調(diào)節(jié)線粒體途徑介導(dǎo)bax表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放出來，繼而激活Caspase-3、Caspase-9，引發(fā) Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡影響卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)［10，11］。與凋亡相關(guān)的基因分為促凋亡基因和抗凋亡基因，而這些基因多數(shù)受miRNAs的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)MIR-29B和miR-15-16、let-7/miR-98 和 miR-17-92 均參與細(xì)胞凋亡［12］。MiR-144過表達(dá)可導(dǎo)致肌細(xì)胞凋亡。miR-378高表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡和壞死。miR-378抑制劑引起常氧條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)顯著的損傷和凋亡。當(dāng)miR-34a表達(dá)發(fā)生異位時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、衰老或細(xì)胞周期靜止。由此推斷miRNAs在細(xì)胞凋亡中起重要的作用。

MiRNAs介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制是控制生殖器官發(fā)育和功能正常的重要機(jī)制。有證據(jù)表明在女性各個(gè)生殖器官內(nèi)均有miRNAs表達(dá)，其主要是對(duì)器官發(fā)育過程中的信號(hào)通路起調(diào)節(jié)作用。尤其對(duì)卵巢發(fā)育，卵泡生長(zhǎng)，女性孕育能力等起著重要的作用。女性生殖器官正常發(fā)育和功能的維持受多種因素的調(diào)節(jié)，由于miRNAs在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修改等水平的調(diào)節(jié)起非常重要的作用，miRNAs可能是控制生殖器官發(fā)育和功能正常的重要機(jī)制之一。利用不同技術(shù)對(duì)miRNAs研究發(fā)現(xiàn)，老鼠卵巢中在卵泡周圍的顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了212種成熟的miRNAs，其中Let-7家族表達(dá)最多。在卵子生長(zhǎng)過程中可檢測(cè)到多種miRNAs的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可能通過調(diào)控卵泡發(fā)育過程的信號(hào)通路來調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)、分化及凋亡［13，14］。當(dāng)miRNAs合成異常時(shí)，則表現(xiàn)為排卵功能異常，卵母細(xì)胞和胚胎的完整性受損、雙側(cè)輸卵管囊腫等［15］。Dicer1是miRNAs成熟過程中的重要內(nèi)切酶之一，Otsuka等［16］發(fā)現(xiàn)Dicer1缺乏的小鼠出現(xiàn)卵子成熟障礙，從而導(dǎo)致不孕。也有研究發(fā)現(xiàn)POF患者與正常對(duì)照組比較，10種miRNA表達(dá)上調(diào)，2種miRNA表達(dá)下調(diào)?？傊ㄟ^研究miRNA在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用，可為如何提高生殖能力提供依據(jù)［17］。

Mir-21含有22個(gè)核苷酸，位于17p23.2染色體區(qū)域的脆性位點(diǎn)FRA17B上［18］。通過對(duì)靶基因的調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡［19］。大量研究發(fā)現(xiàn)Mir-21與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。Carletti等［20］研究發(fā)現(xiàn)Mir-21是促黃體生成素誘導(dǎo)在顆粒細(xì)胞中高表達(dá)的miRNAs的一種，當(dāng)體內(nèi)和體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞Mir-21表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，排卵率降低。目前已在消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等中進(jìn)行了一系列關(guān)于Mir-21調(diào)節(jié)的凋亡靶基因的研究，但Mir-21誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)卵巢功能減退患者較正?；颊進(jìn)ir-21表達(dá)下調(diào)。同時(shí)通過熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，前者顆粒細(xì)胞的凋亡情況較正常組高，進(jìn)一步證實(shí)了Mir-21可能參與顆粒細(xì)胞的凋亡。由于Mir-21作用的靶基因較復(fù)雜，我們將在今后的研究中進(jìn)一步探討Mir-21導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，為如何保護(hù)卵巢功能提供理論依據(jù)。

隨著對(duì)miRNAs作用機(jī)制的進(jìn)一步的深入研究，并不斷利用最新的芯片技術(shù)手段對(duì)miRNsA和疾病之間的關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)理解更加深入透徹。不久的將來miRNAs可能會(huì)成為疾病診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記或臨床指標(biāo)，把這一分子作成藥靶，或是模擬這一分子進(jìn)行新藥研發(fā)，將可能會(huì)給人類疾病的早期預(yù)防、診斷及治療提供新的手段和思路。

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