蔣 超，蔣景龍，沈季雪，伍娜娜，張 慶，徐衛(wèi)平，田 雲(yún)

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

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不同激素對西洋參胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

蔣 超，蔣景龍*，沈季雪，伍娜娜，張 慶，徐衛(wèi)平，田 雲(yún)

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

[目的] 建立高效的西洋參胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系。[方法] 以裂口的西洋參種子為試材，研究不同激素對西洋參種胚脫分化啟動與愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并分析其體胚發(fā)生過程。[結(jié)果] 不同激素對西洋參胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果存在明顯差異，當(dāng)培養(yǎng)條件為MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為96.4%；在解剖顯微鏡下觀察，西洋參體胚發(fā)生過程中球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚清晰可見。[結(jié)論]該研究為西洋參快繁體系的建立和優(yōu)化奠定一定的理論基礎(chǔ)。

西洋參；愈傷組織；培養(yǎng)條件；體細(xì)胞胚

西洋參(PanaxquiquefoliumL.)為五加科人參屬多年生草本植物，是一種比人參溫和的名貴藥材，我國自20世紀(jì)80年代成功大面積引種以來，已發(fā)展成為世界第三大西洋參生產(chǎn)國和第一大消費國，目前已形成東北、華北和西北三大主產(chǎn)區(qū)[1]。西洋參以根入藥，主要含有40多種皂苷、多糖和氨基酸等有效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保護(hù)心血管系統(tǒng)和治療糖尿病肥胖病等功效，在醫(yī)療和保健上應(yīng)用廣泛，市場需求量日益增長[2]。西洋參生長周期長，且易受氣候、地域、環(huán)境栽培條件以及病蟲害影響和栽培連作障礙等問題，利用西洋參愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有效次級代謝產(chǎn)物已有相關(guān)報道[3-5]，但由于西洋參愈傷組織的特性和品質(zhì)差異，往往產(chǎn)量較低，很難滿足實際需求。根據(jù)西洋參種胚形成愈傷組織率高且品質(zhì)好的特點[6]，筆者選取漢中留壩成熟種胚為試材，研究不同條件對西洋參種胚脫分化啟動與愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并分析其體胚發(fā)生過程，為提升西洋參愈傷組織誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)速度、建立一套西洋參高效再生體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

西洋參種子采購于漢中留壩縣西洋參標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)，經(jīng)過1年的沙藏層積、低溫處理，裂口率為85%以上，選擇裂口成熟種子(圖1A)的種胚(圖1B)為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理。挑選沙土中保藏的飽滿、圓潤并出現(xiàn)裂口的西洋參種子，去掉外種皮，并用流水沖洗1～2 h，洗凈，備用。取上述種子用75%的乙醇浸泡20 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞浸泡8 min，并用無菌蒸餾水漂洗4～5次。將消毒后的種子剝離，取其種胚接種于MS+激素的三角瓶中，每瓶接4～5個外植體，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，相對濕度50%～70%，暗培養(yǎng)30 d。

1.2.2 誘導(dǎo)條件的篩選。以MS為基本培養(yǎng)基，內(nèi)含30 g/L的蔗糖和6 g/L的瓊脂，附加不同種類和濃度的激素(表1)。定期統(tǒng)計膨大率和出愈率，并計算相應(yīng)的二級變量。膨大率=M/K×100%，膨大速度=(Mx-My)×[(X-Y)×K]；出愈率=N/K×100%，出愈速度=(Nx-Ny)×[(X-Y)×K]，其中M表示外植體膨大數(shù)，Mx表示第X天膨大的外植體數(shù)，My表示第Y天膨大的外植體數(shù)，N表示外植體膨大數(shù)，Nx表示第X天外植體愈傷數(shù)，Ny表示第Y天外植體愈傷數(shù)，K表示接種外植體總數(shù)。

1.2.3 胚狀體的鑒別。培養(yǎng)30 d后，選擇淺黃色、生長旺盛、新鮮濕潤的愈傷組織接種到含1.0 mg/L 2，4-D的繼代培養(yǎng)基上，繼代3次，繼代周期為20 d，45 d后將疏松愈傷組織在解剖顯微鏡下進(jìn)行解離，觀察體細(xì)胞胚所處時期。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探索不同培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)方式對西洋參愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)效應(yīng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋參胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程

將西洋參種胚接種到不同激素搭配的培養(yǎng)基后，外植體的膨大數(shù)、膨大速度、出愈數(shù)和出愈速度等差異較大(表2)。

表1 西洋參愈傷組織誘導(dǎo)試驗設(shè)計 mg/L

表2 不同組合方式下西洋參種胚膨大數(shù)和出愈數(shù) 個

西洋參種胚接種到含2，4-D的MS培養(yǎng)基上，3 d后M2和M7中外植體開始萌動，并出現(xiàn)明顯可見的膨大，7 d后各組合外植體均出現(xiàn)明顯膨大(圖2A)，14 d左右膨大的胚軸和子葉邊緣有白色突起(圖2B)，膨大部位逐漸形成愈傷組織，其中，M6和M7中形成愈傷組織最多，少數(shù)外植體直接形成愈傷組織，多數(shù)情況下種胚的一端或兩端同時膨大，表面呈紫色色素的積累，隨著時間的延長，色素逐漸退去。培養(yǎng)30 d后，整片子葉及胚軸基部都出現(xiàn)黃色顆粒狀愈傷組織，稱為分生小球體(圖2C)。分生小球體隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大到直徑0.5～2.5 mm的大顆粒，愈傷組織逐漸增多，生長旺盛(圖2D)。培養(yǎng)20 d后，愈傷組織生長旺盛，質(zhì)地疏松，生長量高(圖2E)，繼代3次后，愈傷組織狀態(tài)良好，生長旺盛，質(zhì)地疏松，色澤為鵝黃色，愈傷組織的大小和色澤出現(xiàn)明顯區(qū)別(表3)。培養(yǎng)45 d后，繼代培養(yǎng)基上愈傷組織有胚狀體發(fā)生，胚狀體多成簇狀發(fā)生，基部黏連現(xiàn)象嚴(yán)重(圖2F)。

表3 不同繼代次數(shù)對西洋參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：愈傷組織按大小分成4級，分別記為++++，+++，++，+；-表示無褐化。

2.2 不同組合方式對西洋參種胚膨大的效應(yīng)

膨大在一定程度上反映了外植體細(xì)胞進(jìn)行脫分化的潛能[7]。以不同激素搭配的培養(yǎng)條件為自變量，分別以膨大率和膨大速度為因變量作單因素方差分析。結(jié)果表明，不同激素搭配對西洋參種胚膨大的效應(yīng)顯著(F=3.241，P<0.05)，即在不同激素的搭配下，西洋參種胚膨大率存在明顯差異。從各個處理的效果對比分析，M2外植體膨大效果最好，膨大率均為92.9%(圖3)。不同激素的搭配對西洋參種胚膨大速度也表現(xiàn)極強(qiáng)的顯著性(F=5.098，P<0.01)，其中M6的膨大速度相對最快，為0.082個/d(圖4)。從總體上看，除M2外，西洋參種胚膨大效應(yīng)中的膨大率和膨大速度并未表現(xiàn)出較好的一致性。M8的膨大率達(dá)到很高水平，但膨大速度卻處于較低水平；相反，M6的膨大率雖未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，但膨大速度卻達(dá)到較高水平。

2.3 不同組合方式對西洋參種胚出愈率的影響

出愈率是從靜態(tài)上衡量外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果的一項重要指標(biāo)，它能確定愈傷組織發(fā)生的最佳條件；而出愈速度則是從動態(tài)變化的角度衡量外植體愈傷形成與積累的快慢程度。以不同激素搭配的培養(yǎng)條件為自變量，以出愈率和出愈速度為因變量作一維方差分析。

結(jié)果表明，不同激素搭配對西洋參種胚出愈率和出愈速度的效應(yīng)極顯著(F=4.691，P<0.01；F=16.245，P<0.01)。由圖5、6可知，除M4和M9外，其他激素組合培養(yǎng)下西洋參種胚的出愈率均在70%以上，由此可見，西洋參種胚脫分化相對容易，是誘導(dǎo)愈傷組織的良好外植體來源。從動態(tài)變化看，出愈速度與出愈率之間雖有一定的一致性，但表現(xiàn)并不明顯。M5～M8出愈率相對持平，但出愈速度卻急劇變化，其中M6的出愈速度表現(xiàn)極低的水平(0.004個/d)。

2.4 胚性愈傷組織的鑒定

取繼代2～3次的愈傷組織，挑選一部分鮮嫩、疏松的愈傷組織在解剖鏡下解離觀察，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織表面具致密的球形顆粒，顏色乳白色或黃色，呈半透明狀，質(zhì)地較堅實，繼續(xù)剝離疏松愈傷組織，解離出球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚(圖7)。

3 結(jié)論與討論

該研究表明，以西洋參成熟種胚為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合是MS+6% g/L瓊脂+30 g/L的蔗糖+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為96.4%；在解剖顯微鏡下，西洋參胚性愈傷組織的特征非常明顯，發(fā)生過程清晰可見，依次經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚等過程。

該試驗選擇西洋參種胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)效果顯著，誘導(dǎo)率最高為96.4%，而張成國等[8]以西洋參花藥誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率最高為37.53%。王逸群等[9]以西洋參根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率最高為75.51%。在激素組合方面，張成國等[8]和王逸群等[9]選擇誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合方式均為2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，但誘導(dǎo)率均低于該研究結(jié)果。該研究首次對西洋參胚性愈傷組織所處時期進(jìn)行鑒定，分析其體胚發(fā)生過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西洋參種胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織，胚狀體簇狀發(fā)生率較高，但發(fā)育時期不同步，這些問題將在以后的研究中繼續(xù)探索。該研究為西洋參愈傷組織的誘導(dǎo)和體胚發(fā)生過程，以及通過胚性愈傷組織建立西洋參再生體系奠定基礎(chǔ)。

[1] 周海燕，趙潤懷，傅建國，等.國產(chǎn)西洋參生產(chǎn)及商品規(guī)格質(zhì)量的調(diào)查分析[J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15(4)：324-328.

[2] 宋娟，雷秀娟，尹紅新，等.五加科藥用植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].

特產(chǎn)研究，2014，36(1)：67-73.

[3] KOCHAN E，CHMIEL A.Dynamics of ginsenoside biosynthesis in suspension culture ofPanaxquinquefolium[J].Acta physiologiae plantarum，2011，33(3)：911-915.

[4] 湯飛宇，王華磊，郭玉海.西洋參離體快速繁殖和次生代謝物生產(chǎn)研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27(5)：787-791.

[5] WANG J，GAO W Y，ZHANG J，et al.Dynamic change of metabolites and nutrients in suspension cells ofPanaxquinquefoliumL.in bioreactor[J].Acta physiologiae plantarum，2010，32(3)：463-467.

[6] 胡選萍，曹小勇，秦公偉，等.西洋參不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(3)：48-50.

[7] 張美萍，王義，魏漢蓮，等.西洋參脫分化基質(zhì)優(yōu)化及影響因素[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25(4)：378-381.

[8] 張成國，王英平，姚春林，等.西洋參花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].特產(chǎn)研究，2013(1)：41-45.

[9] 王逸群，周志華.西洋參愈傷組織及愈傷組織中人參皂苷Rg1和Rb1含量分析[J].漳州師范學(xué)院學(xué)報，2005，18(4)：62-66.

The Effect of Different Hormones on The Induction of Embryogenic Callus inPanaxginsengL.

JIANG Chao，JIANG Jing-long*，SHEN Ji-xue et al

(College of Bioscience & Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong , Shaanxi 723001)

[Objective] To establish a high-efficiency embryogenic callus induction ofPanaxginsengL.. [Method] Taking the seeds ofPanaxginsengL. with openings as test material,the effect of different culture conditions on the callus induction from embryonic axis explants ofPanaxginsengL. was studied, and the process of somatic embryogenesis were analyzed. [Result] The result showed significant differences by studying influence of inducement for callus in different hormones. Orthogonal experiment indicated that the culture conditions: MS + 2,4-D 0.5 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L + IBA 0.5 mg/L had extremely significant callus effect, the induction rate up to 96.4%. ThePanaxginsengL. somatic embryogenesis could be observed clearly, which experienced globular embryo heart-shaped embryo, torpedo-shaped embryo and cotyledon embryo under a dissecting microscope. [Conclusion] The study provide some theoretical basis for the establishment and optimization of rapid propagation system.

PanaxquiquefoliumL.; Callus; Culture condition; Somatic embryo

陜西省科技廳基金項目(2015KTTSSF01-02)；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項目(SLGYCX1517)。

蔣超(1988- )，男，四川資陽人，碩士研究生，研究方向：西洋參無性快速繁殖研究。*通訊作者，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物細(xì)胞工程研究。

2015-11-09

S 567

A

0517-6611(2015)35-234-04