宋 凱，嚴(yán)忠雍，張小軍，郭遠(yuǎn)明

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100)

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UPLC-MS-MS法檢測(cè)水產(chǎn)品中亮綠·孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物

宋 凱，嚴(yán)忠雍，張小軍，郭遠(yuǎn)明

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100)

[目的] 建立水產(chǎn)品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亮綠的快速檢測(cè)方法。[方法] 采用氯化鈉溶液與二氯甲烷液液萃取凈化，建立快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亮綠的超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。[結(jié)果]孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亮綠5種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.992，信噪比均在10以上，加標(biāo)回收率為80.40%～119.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～6.2%，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。[結(jié)論] 建立的UPLC-MS-MS方法適用于水產(chǎn)品中亮綠、孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的檢測(cè)。

亮綠；孔雀石綠；結(jié)晶紫；隱色孔雀石綠；隱色結(jié)晶紫；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亮綠都屬于堿性三苯甲烷類(lèi)染料，具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)(圖1)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中常用作殺菌劑和抗寄生蟲(chóng)藥，用于防治各種魚(yú)病[1-3]。由于三苯甲烷具有致突變、致畸和致癌作用，歐美、我國(guó)和日本等已經(jīng)嚴(yán)禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用孔雀石綠和結(jié)晶紫，并規(guī)定孔雀石綠(含隱色孔雀石綠)和結(jié)晶紫(含隱色結(jié)晶紫)不得檢出[4-6]?？兹甘G因其效果明顯、價(jià)格低廉而被大量應(yīng)用于鰻魚(yú)、鯉魚(yú)、鯽魚(yú)及其他水產(chǎn)苗種中，主要用于防治水霉病。但是，獸藥殘留作為水產(chǎn)品安全的首要問(wèn)題直接影響到我國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全及其出口創(chuàng)匯[7-9]。目前，在生產(chǎn)中使用孔雀石綠的不多，主要集中在水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)。

因此，對(duì)于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的持續(xù)檢測(cè)和監(jiān)控十分重要。

目前，水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)方法有高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法[10-15]，但液相色譜法有其缺陷性，主要表現(xiàn)為方法的檢出限已達(dá)不到越來(lái)越嚴(yán)格的市場(chǎng)要求，目前通常采用乙腈提取亮綠、孔雀石綠與結(jié)晶紫，采用正己烷進(jìn)行去脂凈化[16-20]，但正己烷會(huì)造成目標(biāo)物損失，特別是隱色結(jié)晶紫和隱色孔雀石綠損失。為了降低目標(biāo)物的損失率，筆者采用氯化鈉溶液與二氯甲烷液液萃取凈化，在保證高回收率的同時(shí)降低了樣品的基質(zhì)干擾，提高了靈敏度，適用于水產(chǎn)品中亮綠、孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1.1 儀器。UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司)；食品加工機(jī)(飛利浦)；高速離心機(jī)TDL-5-A(上海飛鴿)；旋渦混合器XW-80A(上海青浦滬西)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀NA-1001-WA(日本東京EYELA)；中性氧化鋁小柱(LC-Alumina-N)。

1.1.2 試劑及其配制?？兹甘G、結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠、隠色結(jié)晶紫、亮綠，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、異丙醇、乙酸銨、甲酸、冰乙酸均為色譜純，購(gòu)自天津科密歐公司；氯化鈉、硫酸鈉，均為分析純，購(gòu)自天津科密歐公司；超純水，使用Millipore超純水器自制。取0.5 ml甲酸加入到500 ml的乙腈中，搖勻。稱(chēng)取0.19 g乙酸銨溶于500 ml水，然后向其中加入0.5 ml甲酸，搖勻。按照乙腈：5 mmol/L乙酸銨(用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5)=8∶2進(jìn)行定容。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。分別稱(chēng)取10.000 0 mg(精確至0.000 1 mg)的MG、LMG、CV、LCV、BG 5種標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 ml，制成濃度為100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃條件下避光保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。各取MG、LMG、CV、LCV、BG儲(chǔ)備液10 ml，用乙腈稀釋定容至100 ml，制成濃度為10 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃避光保存。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液及工作液的配制。移取10 ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋定容至100 ml，制成1 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，標(biāo)準(zhǔn)品工作液按照需要逐級(jí)稀釋?zhuān)蜐舛葮?biāo)準(zhǔn)品工作液臨用時(shí)使用定容溶劑稀釋配制。

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：BEH C18柱(2.1 mm×50 mm)，粒徑1.7 μm；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：20 ℃；進(jìn)樣體積：5 μl；流動(dòng)相：A緩沖鹽溶液(5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.1%的甲酸)、B乙腈(0.1%的甲酸)；流速為0.25 ml/min 梯度洗脫，具體梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源：正離子電離(ESI+)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：100 ℃；二級(jí)錐孔電壓：3 V；錐孔反吹氣：50 L/h；去溶劑氣溫度：350 ℃；去溶劑氣流量：700 L/h；低質(zhì)量分辨率LM1 13.0，高質(zhì)量分辨率HM1 13.0，離子能量1為0.5 V，碰撞室入口電壓為0 V，碰撞室出口電壓為0 V，碰撞氣流量為0.2 ml/min，碰撞室壓力為3.0×10-3Pa，低質(zhì)量分辨率LM2為13.0，高質(zhì)量分辨率HM2為13.0，離子能量2為1.0 V，光電倍增管電壓為650 V。在質(zhì)譜分析過(guò)程中，以保留時(shí)間和離子對(duì)信息比較進(jìn)行定性分析，以母離子和響應(yīng)值高的子離子進(jìn)行定量。孔雀石綠等5種化合物在MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.5 方法

1.5.1 取樣。取水產(chǎn)品可食用部分充分絞碎混勻后，稱(chēng)取5.00 g(精確至0.01 g)置于50 ml離心管中。

1.5.2 提取。向離心管中加入15 ml乙腈，充分振蕩提取，旋渦混合3 min，5 000 r/min離心分離，重復(fù)提取1次，合并2次上清液，并轉(zhuǎn)入250 ml分液漏斗中。

1.5.3 轉(zhuǎn)容凈化。向分液漏斗中加入20 ml 10%氯化鈉水溶液，20 ml二氯甲烷，振蕩3 min(注意放氣)，靜置分層后，去除下層水相；上層乙腈和二氯甲烷層過(guò)預(yù)先用乙腈淋洗的無(wú)水硫酸鈉脫水凈化，并收集到茄形瓶中，然后用20 ml乙腈分?jǐn)?shù)次洗滌硫酸鈉，濾液一并轉(zhuǎn)入茄形瓶中。

1.5.4 濃縮溶解。加入10 ml異丙醇，40 ℃以下濃縮至干，用2 ml定容溶液溶解殘?jiān)?/p>

1.5.5 再凈化。殘?jiān)芙庖哼^(guò)中性氧化鋁，前面3～5滴流出液棄去，全部收集隨后的流出液并過(guò)0.2 μm濾膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)

將濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為5 μl，化合物MG、LMG、CV、LCV和BG的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.998 026、0.994 963、0.995 248、0.992 089和0.995 606。

2.2 檢測(cè)限

進(jìn)樣0.5 μg/L的5種化合物(MG、LMG、CV、LCV、BG)的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將儀器檢測(cè)限定為1.0μg/L，孔雀石綠(MG)、隱色孔雀石(LMG)、結(jié)晶紫(CV)、隱色結(jié)晶紫(LCV)和亮綠(BG)在UPLC/MS/MS上的信噪比分別為1 072.37、1 177.39、138.26、39.29和210.35。

2.3 質(zhì)譜分析結(jié)果

從圖2可以看出，孔雀石綠、隱色孔雀石、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫和亮綠的保留時(shí)間分別為2.22、2.77、2.30、2.57和2.42 min。

2.4 添加回收試驗(yàn)

分別以魷魚(yú)和章魚(yú)為空白樣品進(jìn)行基質(zhì)回收試驗(yàn)，在0.1和0.2 μg/kg水平上進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。由表3可知，亮綠、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫的平均回收率為80.40%～119.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%～6.2%，說(shuō)明具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 魷魚(yú)和章魚(yú)中5種化合物的回收率

3 小結(jié)

該試驗(yàn)建立的UPLS-MS-MS方法避免了目標(biāo)物的大量損失，在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下對(duì)孔雀石綠(隱)、結(jié)晶紫(隱)和亮綠5種化合物實(shí)現(xiàn)了有效分離，并且出峰時(shí)間合適，檢測(cè)靈敏度較高，精密度良好，回收率較高，方法檢測(cè)定量限為5μg/kg，適用性均良好，可滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亮綠5種化合物的檢測(cè)要求。

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Detection of Residual Amount of Malachite Green, Leucomalachite Green, Crystal Violet, Leuco Crystal Violet and Bright Green in Aquatic Products by UPLC-MS-MS

SONG Kai, YAN Zhong-yong, ZHANG Xiao-jun et al

(Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhejiang Province Key Lab of Mariculture & Enhancement, Zhoushan，Zhejiang 316100)

[Objective] The aim was to establish rapid detection method of malachite green, leuco-malachite green, crystal violet, leuco-crystal violet and bright green in aquatic products. [Method] The compounds were extracted and purified with sodium chloride solution and dichloromethane to establish UPLC-MS-MS for rapidly detecting malachite green , leucomalachite green, crystal violet, leucocrystal violet and bright green in aquatic products. [Result] The correlation coefficients of the standard curve of five kinds of compounds(malachite green, leuco-malachite green, crystal violet, leuco-crystal violet and bright green ) were all more than 0.992, the signal-noise ratio was all more than 10, and the addition recovery was 80.40%-119.7% withRSDof 3.4%-6.2%, which indicated that the detection method had good accuracy and precision. [Conclusion] The established UPLC-MS-MS is suitable for detecting malachite green, leuco-malachite green, crystal violet, leuco-crystal violet and bright green in aquatic products.

Bright green；Malachite green；Crystal violet；Leucomalachite green；Leucocrystal violet；UPLC- MS-MS

浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2015C32001)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014F50001)。

宋凱(1983- )，男，山東德州人，工程師，碩士，從事水域環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品檢測(cè)。

2015-10-31

S 912

A

0517-6611(2015)35-164-03