陳 航，蔡燦輝，張 彪，韋存虛

(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225009)

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植物貯藏組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)定量分析方法

陳 航，蔡燦輝，張 彪，韋存虛

(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225009)

[目的]為了建立植物貯藏組織細(xì)胞的形態(tài)定量分析方法。[方法]利用Photoshop軟件處理顯微形態(tài)圖片，借助形態(tài)分析軟件定量測(cè)定細(xì)胞形態(tài)參數(shù)。[結(jié)果]該方法首先詳細(xì)介紹了如何利用Photoshop軟件獲得只含有細(xì)胞壁輪廓的顯微圖片過程，然后利用形態(tài)分析軟件定量測(cè)定細(xì)胞的面積、圓度、長(zhǎng)軸和短軸等形態(tài)特征。[結(jié)論]該方法不僅克服采用常規(guī)方法對(duì)植物貯藏細(xì)胞形態(tài)分析結(jié)果不準(zhǔn)確等的缺陷，而且適用于采用不同樣品制備方法獲得的顯微結(jié)構(gòu)圖。

植物貯藏組織；細(xì)胞形態(tài)；定量分析；Photoshop軟件

植物貯藏組織是糧食、牲畜飼料和工業(yè)原料的主要來源。貯藏組織細(xì)胞的發(fā)育和充實(shí)狀況決定著植物貯藏組織的質(zhì)量和品質(zhì)。對(duì)貯藏組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分析，能夠從細(xì)胞學(xué)角度研究植物貯藏組織的發(fā)育和充實(shí)，對(duì)提高植物貯藏組織的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義[1]。目前，對(duì)植物組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)的研究主要利用顯微切片技術(shù)將組織細(xì)胞切開，再通過染色顯示出細(xì)胞的輪廓，最后用一些形態(tài)分析軟件測(cè)定細(xì)胞的形態(tài)學(xué)指標(biāo)[2]。但是，由于植物貯藏組織細(xì)胞被貯藏物質(zhì)淀粉、蛋白和脂類物質(zhì)所填充，染色后的細(xì)胞輪廓不夠清晰，采用常規(guī)的方法無法準(zhǔn)確定量分析植物貯藏組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的摸索，筆者建立了一種植物貯藏組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)定量分析方法。該方法可以方便、準(zhǔn)確地分析細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。以水稻成熟籽粒為例，筆者詳細(xì)介紹了該分析方法的具體操作過程，為植物貯藏組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)定量分析提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 水稻種子半薄切片的制備、染色和拍照

以水稻成熟種子為材料，參考楊洋[3]的常規(guī)LR white樹脂包埋法對(duì)樣品進(jìn)行固定、脫水、樹脂滲透和包埋，獲得樣品包埋塊。將包埋塊置于萊卡超薄切片機(jī)上，利用玻璃刀切取2 μm厚的半薄切片，將切片黏于載玻片上；利用碘液對(duì)樣品中的淀粉進(jìn)行染色；在奧林巴斯顯微鏡下觀察和拍照染色后的樣品，獲得顯微圖片。

1.2 顯微圖片的處理

用Photoshop軟件對(duì)顯微圖片進(jìn)行處理，獲得只顯示細(xì)胞輪廓的圖片。具體步驟如下：

(1)用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，用“矩形選框工具”選出待分析的區(qū)域，點(diǎn)選菜單欄的“編輯”-“拷貝”，再點(diǎn)選“文件”-“新建”，在彈出的對(duì)話框中將背景內(nèi)容改為“背景色”，點(diǎn)擊“確定”新建一個(gè)像素與待分析的區(qū)域相同的畫布。

(2)點(diǎn)選菜單欄的“編輯”-“黏貼”，將待分析的區(qū)域復(fù)制到新畫布上。

(3)選擇“鋼筆工具”，逐一對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒。

(4)打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標(biāo)”，輸入路徑名稱，點(diǎn)擊“確定”保存路徑。

(5)選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“3”像素，“硬度”改為“100%”。

(6)選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，在對(duì)話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，待分析區(qū)域清晰地顯示出胚乳細(xì)胞的輪廓。

(7)在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復(fù)制圖層”，點(diǎn)擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動(dòng)該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，在對(duì)話框中選擇“畫筆工具”，點(diǎn)擊“確定”，顯示出背景為黑色、細(xì)胞輪廓為白色的圖像。

(8)點(diǎn)選菜單欄的“文件”-“存儲(chǔ)為”，保存為TIF格式的無損圖片。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

經(jīng)Photoshop軟件處理的細(xì)胞輪廓圖片可以用任何一種形態(tài)分析軟件進(jìn)行分析。以下是筆者使用美國(guó)Media Cybernetics公司研發(fā)的一款圖像分析軟件Image-Pro Plus(IPP)對(duì)細(xì)胞輪廓圖片進(jìn)行分析的過程。

(1)標(biāo)尺設(shè)定。用IPP軟件打開C1型測(cè)微尺圖片，點(diǎn)選菜單欄的“Measure”-“Calibration”-“Spatial”，在彈出的窗口中點(diǎn)選“New”新建標(biāo)尺，在上方的“Name”一欄下的“spatial cal 0”處點(diǎn)一下，輸入標(biāo)尺名“10X”?！癠nit”一欄選擇“μm”作為單位，勾選“convert when change unit”。點(diǎn)選“Units/pixel”一欄中的“Image”，彈出“scaling”對(duì)話框，同時(shí)在標(biāo)尺圖片左上角顯出一個(gè)標(biāo)尺，將鼠標(biāo)移到這個(gè)標(biāo)尺的橫杠上，點(diǎn)一下左鍵，光標(biāo)就立即變成小手，就用這個(gè)小手把標(biāo)尺拖下來，再將小手依次移到橫杠的左右兩端，利用“放大鏡”工具，用左鍵拖這兩個(gè)端點(diǎn)到圖片兩邊的標(biāo)尺處，在“scaling”對(duì)話框中填上標(biāo)尺長(zhǎng)度，點(diǎn)擊“OK”關(guān)閉對(duì)話框。

(2)定義標(biāo)尺。點(diǎn)選菜單欄的“Measure”-“Calibration”-“Select Spatial”，在彈出的窗口中點(diǎn)選新建的“10X”標(biāo)尺。

(3)點(diǎn)選菜單欄的“Measure”-“count/size”，彈出“count/size”對(duì)話框。

(4)點(diǎn)選對(duì)話框菜單欄的“Measure”-“Select Measurements”，彈出“Select Measurements”對(duì)話框，點(diǎn)選所需測(cè)量的參數(shù)，這里選擇“Area(面積)”“Roundness(圓度)”“Size(length)(長(zhǎng)軸長(zhǎng)度)”和“Size(width)(短軸長(zhǎng)度)”，點(diǎn)擊“OK”返回“count/size”對(duì)話框。

(5)點(diǎn)選“Automatic Dark Objects”，勾上“Measure Objects”“Apply Filter Ranges”和“Display Objects”復(fù)選框，點(diǎn)擊“Count”按鈕完成參數(shù)的計(jì)算。

(6)點(diǎn)選對(duì)話框菜單欄的“View”-“Measurement Data”，獲得胚乳細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，其中面積單位為μm2，圓度單位為μm2/μm2，長(zhǎng)度單位為μm。

(7)各參數(shù)的含義?！癆rea”表示測(cè)量對(duì)象的面積；“Roundness”表示對(duì)象的圓度，計(jì)算公式 =(周長(zhǎng)2)/(4×π×面積)；圓物體的圓度為1，其他形狀圓度大于1；“Size(length)”表示對(duì)象沿主軸(長(zhǎng)軸)方向的對(duì)象投影輪廓兩邊界平行線間的距離直徑；“Size(width)”表示對(duì)象沿副軸(短軸)方向的對(duì)象投影輪廓兩邊界平行線間的距離直徑。

2 結(jié)果與分析

圖1顯示水稻胚乳切片顯微結(jié)構(gòu)圖。胚乳細(xì)胞內(nèi)充滿淀粉，細(xì)胞壁輪廓可以被辨認(rèn)，但無法直接用軟件分析胚乳細(xì)胞形態(tài)。使用該研究中介紹的方法，可以方便、準(zhǔn)確地勾劃出細(xì)胞壁(圖2)。將圖1的背景刪除，保留勾劃的細(xì)胞壁，獲得只含有細(xì)胞壁輪廓的圖3。利用形態(tài)分析軟件，可以對(duì)圖3的每個(gè)胚乳細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行快速、批量和準(zhǔn)確地定量分析，獲得每個(gè)細(xì)胞的相關(guān)信息(表1)。

表1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)

隨著人們研究工作的深入，越來越多的定量分析取代了以前的定性分析。近年來，圖像分析軟件在植物組織細(xì)胞形態(tài)中的定量分析中得到迅速普及[4-5]。然而，由于植物不同組織的特殊性，一些植物組織如富含內(nèi)含物的貯藏組織很難利用圖像分析軟件獲得可靠性的定量分析結(jié)果。筆者首先利用Photoshop軟件對(duì)要分析的顯微結(jié)構(gòu)圖片進(jìn)行處理，再運(yùn)用圖像分析軟件批量、快速和準(zhǔn)確地分析每個(gè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。該方法不僅適用于樹脂半薄切片，而且適用于石蠟切片。只要獲得的顯微結(jié)構(gòu)圖中能夠辨別細(xì)胞壁的輪廓，就能用該方法進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)論與討論

利用該研究所建立的方法，可以方便、準(zhǔn)確地對(duì)植物細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行定量分析。該方法能夠?qū)Σ煌参锝M織來源的

不同樣品制備方法獲得的顯微結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行準(zhǔn)確、定量分析，為植物細(xì)胞形態(tài)學(xué)的定量分析提供準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定方法。

[1] CAI C，HUANG J，ZHAO L，et al.Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies [J].Journal of agricultural and food chemistry，2014，62：10142-10152.

[2] 王永平，許科帝，鄭筱祥.線粒體形態(tài)學(xué)全自動(dòng)定量分析方法[J].計(jì)算機(jī)應(yīng)用，2010，30(11)：2991-2994.

[3] 楊洋.抑制淀粉分支酶基因表達(dá)影響稻米外觀品質(zhì)的細(xì)胞學(xué)和發(fā)育學(xué)研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014：15-16.

[4] 劉智，王玲玲，周衛(wèi)東，等.用Image J分析水稻胚乳淀粉粒表面幾何特征的方法[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2011，30(4/5)：466-471.

[5] 余徐潤(rùn)，周亮，荊彥平，等.Image-Pro Plus軟件在小麥淀粉粒顯微圖像分析中的應(yīng)用[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2013，32(4)：344-351.

Quantitative Analysis Method of Cell Morphology of Plant Storage Tissue

CHEN Hang, CAI Can-hui, ZHANG Biao et al

(Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009)

[Objective] A quantitative analysis method was established to accurately analyze the cell morphology of plant storage tissue. [Method] Microphotograph was treated by Photoshop software, and cell morphology was quantitatively analyzed by morphology analysis software. [Result] The method firstly introduced the detail processes to obtain the microphotograph with only cell wall by Photoshop software. The cell morphology, such as area, roundness, long axis and short axis, was quantitatively investigated using morphology analysis software. [Conclusion] The method is not only more accurate with quantitative analysis of the cell morphology of plant storage tissue than the routine method, but also applicable to the microphotographs obtained from different sample preparation methods.

Plant storage tissue; Cell morphology; Quantitative analysis; Photoshop software

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31270221)。

陳航(1969- )，男，江蘇揚(yáng)州人，中級(jí)職稱，從事儀器設(shè)備管理研究工作。

2015-11-20

S-03

A

0517-6611(2015)35-001-02