張冰清,杭柏林,夏一赫,魏曉曉,楊雪峰,胡建和

(河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

牛脾臟粗提物的抗菌活性分析

張冰清,杭柏林,夏一赫,魏曉曉,楊雪峰,胡建和

(河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

為獲得具有抗菌作用的物質(zhì),研究對牛脾臟粗提物進行了提取,并通過抑菌試驗檢測了粗提物對幾種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的抑菌活性.結(jié)果表明：牛脾臟粗提物對產(chǎn)氣腸桿菌和變形桿菌具有較好的抑菌活性,但對大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌(疫苗株)沒有明顯抑制作用.牛脾臟粗提物中存在著抗菌活性物質(zhì).

牛脾;粗提物;抗菌活性;分析

牛是我國重要的經(jīng)濟動物.但是,目前細菌性、病毒性和寄生蟲性傳染病一直威脅著動物的健康,進而阻礙了我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展,也影響著國民經(jīng)濟增長[1].抗生素和疫苗在預(yù)防動物傳染病方面發(fā)揮了重要作用.但是近年來,由于藥物的濫用,藥物殘留和細菌耐藥性等問題日漸嚴重,不僅一直困擾著養(yǎng)殖業(yè),而且引發(fā)了人們對食品安全的關(guān)注,給人類的健康帶來潛在的威脅[2].因此,要選擇其他替代物來預(yù)防和治療動物傳染病.動物的天然免疫系統(tǒng)中有很多的先天抗病原分子,如補體分子、干擾素、限制因子、溶菌酶、抗菌肽等[3-4],因此,從動物體內(nèi)尋找天然分子用于動物傳染病的預(yù)防和治療是一個很有前景的選擇[5-6].脾臟是動物的外周免疫器官,是發(fā)揮貯血、濾血和免疫應(yīng)答等功能的器官.脾臟中有很多免疫細胞,如T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等[7-8],由這些細胞所合成與分泌的物質(zhì)具有抵抗外來病原微生物的功能,從而保障機體健康.所以,從脾臟中分離具有抗菌活性的物質(zhì)具有重要的理論意義和臨床實踐意義.

為此,本研究擬從牛脾臟中提取具有抗菌活性的物質(zhì)用于動物傳染病的預(yù)防和治療,為養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供幫助.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 牛脾臟來源 無菌操作采集河南省衛(wèi)輝市世魁牛肉清真屠宰場檢驗員確認為無傳染病感染的牛的新鮮脾臟,于4～10℃冷藏條件下運至河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院的預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室,放入-80℃冰箱中保存,備用.

1.1.2 細菌來源 研究所用細菌包括大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和炭疽桿菌(疫苗株),由河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院的預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室保存.

1.1.3 常規(guī)試劑 蛋白胨(上海匯合生物科技有限公司)、牛肉膏(長葛沃凱德食品配料有限公司)、營養(yǎng)瓊脂(廣州市鴻洲實驗器材科技有限公司)、無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)、氯化鈉(義烏市安格醫(yī)療器械有限公司)、香柏油(長沙市裕豐化玻器械有限公司)、二甲苯(青島正華化工有限公司)、革蘭染色試劑盒(麗水市中益生物技術(shù)有限公司)、亞甲基藍(博湖生物有限公司)、冰乙酸(鄭州三聯(lián)商貿(mào)有限公司)等均為試驗常規(guī)試劑.

1.1.4 大中型儀器 超低溫冰箱(Thermo)、普通冰箱(博西華家用電器有限公司)、生物顯微鏡(淄博森源電氣有限公司)、水平振蕩儀(國華電器有限公司)、高壓蒸餾滅菌器(Hirayama)、超凈工作臺(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司)、天平(sartorius)、微量移液器(eppendorf)、干烤箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、高速冷凍離心機(Thermo)、純水儀(Thermo)、紫外分光光度儀(BioDrop)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅東玻璃制品有限公司)、凍干機(青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司)、制冰機(SANYO)、組織勻漿機(T18 basic)、超聲破碎儀(南京新辰生物科技有限公司)、SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵(河南省金博儀器制造有限公司)等均為實驗室常規(guī)儀器.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2～7.4)和營養(yǎng)肉湯(牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,磷酸二氫鉀5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2～7.4),121℃滅菌20 min.制備過程按文獻[9]進行.

1.2.2 牛脾臟粗提物的制備 按照文獻[5-6]制備牛脾臟粗提物.制備過程簡述如下:將脾臟從-80℃冰箱中取出,室溫下解凍;去除表皮包膜;加入適量質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水,攪勻后組織勻漿;細胞破碎(破碎儀調(diào)至超聲8 s,間隔4 s,35%Amp,15 min);加入質(zhì)量分數(shù)為5%的乙酸,冰浴中攪拌6 h;低溫離心,8 000 r/min、30 min、4℃;取上清,混合,放于4℃冰箱;沉淀混合后,重復(fù)攪拌、離心;混合所有上清,45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)6～8 h;凍干,然后-80℃保存.使用時,用滅菌去離子水稀釋,用紫外分光光度儀測定蛋白濃度.

1.2.3 細菌懸液的制備 將6種受試細菌分別接種營養(yǎng)肉湯,37℃培養(yǎng)12 h,取細菌培養(yǎng)液按文獻[10]的方法進行細菌計數(shù).然后用滅菌生理鹽水將6種受試細菌均調(diào)整菌落濃度為1.0×106CFU/mL.

1.2.4 抗菌活性檢測 采用藥敏紙片法[11]檢測牛脾臟粗提物的抗菌活性.按文獻[12]的方法制備滅菌紙片.抗菌活性檢測過程簡述如下:在超凈工作臺上,將50 μL計數(shù)的細菌懸液置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,用滅菌"L"形玻璃涂棒將細菌涂布均勻;用滅菌鑷子取滅菌紙片貼到培養(yǎng)基表面,輕按幾下;在滅菌紙片上滴10 μL牛脾提取物;然后置于37℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果并測定抑菌圈直徑.

2 結(jié)果與分析

2.1 牛脾臟粗提物的制備

凍干后的牛脾臟粗提物用滅菌去離子水溶解后,通過紫外分光光度儀測定的質(zhì)量濃度為5.36 g/L.

2.2 牛脾臟粗提物抗革蘭陽性菌結(jié)果

經(jīng)抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn),牛脾臟粗提物對金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌(疫苗株)沒有形成抑菌圈.這表明,牛脾臟粗提物對這2種革蘭陽性菌沒有抗菌作用.

2.3 牛脾臟粗提物抗革蘭陰性菌結(jié)果

牛脾臟粗提物抗革蘭陰性菌結(jié)果如表1所示.牛脾臟粗提物對變形桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌有抗菌活性,形成了明顯的抑菌圈(如圖1所示);但牛脾臟粗提物對沙門菌和大腸桿菌沒有抑制作用.

表1 牛脾臟粗提物抗革蘭陰性菌結(jié)果Tab.1 Results of crude extraction from bovine spleen against Gran negative bacterium

圖1 牛脾臟粗提物對產(chǎn)氣腸桿菌和變形桿菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of crude extraction from bovine spleen against Enterobacter aerogenes and Proteus

3 討論

脾臟中有很多的免疫活性細胞,是識別和清除病原微生物的主要器官[3,8].本研究獲得的牛脾粗提物有抗菌活性,表明牛脾臟粗提物中存在著抗菌活性物質(zhì).但是,牛脾臟粗提物的抑菌作用有選擇性(對某些細菌有活性,對某些細菌卻沒有活性).這種選擇性可能有幾個原因[12-15]:(1)抑菌物質(zhì)的濃度,抑制細菌所需要的抑菌物質(zhì)需要有最低的濃度,本研究選擇了不同的細菌和真菌,抑制這些細菌就需要不同的濃度,而本研究中卻僅采用了一種濃度,這也可能是有些細菌沒有抑菌活性結(jié)果的原因;(2)細菌的濃度,細菌濃度越高,抑制其生長所需要的抑菌物質(zhì)濃度也相應(yīng)增加,而在本研究中,沒有對細菌的濃度進行測定,在進行抑菌活性測定時有的細菌濃度明顯偏高,而本研究中抑菌物質(zhì)卻僅采用了一種濃度,這可能是某些細菌沒有出現(xiàn)抑菌圈的原因;(3)抑菌物質(zhì)的純度問題,抑菌物質(zhì)的純度高,其抑菌活性會表現(xiàn)得很明顯,而在本研究中,抑菌物質(zhì)是從牛脾臟中得到的粗提物,是一種混合物,其中含有很多的物質(zhì),某些物質(zhì)有抑菌活性,但可能被其他物質(zhì)所包裹或掩蓋,使得對某種細菌的抑菌活性沒有表現(xiàn)出來.

目前,我國動物疫病不斷發(fā)生,老的疫病尚未消滅,新的疫病不斷出現(xiàn).因此,我國動物疫病的預(yù)防和控制面臨著嚴峻的考驗.抗生素的大量使用和濫用以及藥物殘留問題一直困擾著人類和動物的健康[16].尋找可用于預(yù)防和治療動物疫病的新型有效藥物迫在眉睫.天然提取物具有安全、有效、來源廣等優(yōu)點.利用牛脾粗提物的抑菌活性開發(fā)新型的動物疫病治療藥物,在防治動物疾病、生產(chǎn)綠色食品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

4 結(jié)論

本研究證明了牛脾粗提物有抗菌活性,對變形桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌有抑制作用,但不能抑制金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌(疫苗株)、大腸桿菌和沙門菌的生長.

[1]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[2]董玉瑛,張陽,郭幸麗,等.畜牧業(yè)中抗生素的環(huán)境歸趨危害與防治[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(6):2512-2513.

[3]楊漢春.動物免疫學(xué)[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2003.

[4]李冠楠,夏雪娟,隆耀航,等.抗菌肽的研究進展及應(yīng)用[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2014,26(1):17-25.

[5]趙志雨,王青,杭柏林,等.大腸桿菌誘導(dǎo)對肉雞白細胞粗提物抗菌活性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,42(4):149-152.

[6]胡建和,杭柏林,徐彥召,等.動物源抗菌肽[M].北京:科學(xué)出版社,2015.

[7]HU J H,XU ML,HANG B L,et al.Isolation and characterization ofan antimicrobialpeptide frombovine hemoglobin α-subunit[J]. World J Microbiol Biotechnol,2011,27:767-771.

[8]胡建和,王麗榮,杭柏林.動物微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2006.

[9]陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[10]Seo J K,Crawfoud J M,Ston K L,et al.Purification of a novel arthropod defensin from the American oysrer,Crassostrea virginica[J].Biochem and Biophys Res Commun,2005,338(4):1988-2004.

[11]曹英林,周亞濱.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與微生物實驗[M].北京:科學(xué)出版社,2000.

[12]姜麗麗,尚德靜.中國林蛙皮膚抗菌肽抗菌的特性[J].動物學(xué)雜志,2008,42(4):1-6.

[13]盛長忠,耿華,葉玲玲,等.家蠅蛹血淋巴抗菌活性的誘導(dǎo)及相關(guān)蛋白/多肽的表達規(guī)律[J].南開大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2002,35(1):7-11.

[14]孫振紅,魏凱,譚燕玲,等.蘆薈粗提物抑菌及抗病毒作用的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011,33(9):694-698.

[15]李剛,尹志剛,陳振,等.拮抗細菌EBS05生長曲線及粗提物抑菌活性測定[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,56(3):369-372.

[16]Iglesias A,Nebot C,Vázquez B I,et al.Detection of veterinary drug residues in surface waters collected nearby farming areas in Galicia North of Spain[J].Environ Sci Pollut Res,2014,21(3):2367-2377.

（責任編輯：盧奇）

Bacteriostasis analysis of crude extract from bovine spleen

ZHANG Bingqing,HANG Bolin,XIA Yihe,WEI Xiaoxiao,YANG Xuefeng,HU Jianhe
(Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

To gain material which has antibacterial effect,the crude extraction from bovine spleen were carried out, and bacteriostatic experiment tests against several gram-positive bacteria and gram-negative bacteria were performed.The results showed that the crude extract from bovine spleen has bacteriostatic on Enterobacter aerogenes and Proteus,but has no antibacterial activity on E.coli,Salmonella,Staphylococcus aureus and Bacillus anthrax vaccine strain.This indicates that crude extract from bovine spleen has materials which has antimicrobial activity.

bovine spleen;crude extract;antimicrobial activity;analysis

S823

：A

：1008-7516（2015）05-0045-03

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.05.010

2015-06-11

國家自然科學(xué)基金項目(31372469);河南省科技計劃項目(142300410142);河南科技學(xué)院研究生創(chuàng)新基金(YCX201402)

張冰清(1989-),女,河南商丘人,碩士生.主要從事動物病原與新獸藥的研究.

胡建和(1968-),男,河南輝縣人,博士,教授,碩士生導(dǎo)師.主要從事動物微生物研究.