張婷婷，張瑞英，陳 鎮(zhèn)，羅義庭，熊興良

(重慶醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶400016)

0 引 言

鎘離子(Cd2+)是一種廣泛存在于空氣、水和食物中的對(duì)人體健康危害極大的重金屬污染物。Cd 中毒能導(dǎo)致腎功能衰退、生殖障礙、Itai－Itai 病、骨質(zhì)疏松、呼吸系統(tǒng)疾病等。長(zhǎng)期、低劑量Cd2+暴露能顯著增加患癌的危險(xiǎn)［1］，因此，國(guó)際抗癌聯(lián)盟(IARC)將其確定為Ⅰ類致癌物。傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法主要有原子吸收法(AAS)、陽(yáng)極溶出伏安法(ASV)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP－AES)等［2］。這些方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在樣品前處理復(fù)雜、操作耗時(shí)、儀器昂貴、需要專業(yè)人員操作等缺陷，難以滿足快速、實(shí)時(shí)的檢測(cè)［3］。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)規(guī)定飲用水中Cd2+含量不超過(guò)10×10－9，但基于應(yīng)急檢測(cè)的某些特殊水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(如軍隊(duì)?wèi)?zhàn)時(shí)飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))將上述Cd 含量的限值放寬10 倍甚至100 倍以上［4］。因此，開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、高靈敏和高選擇性的Cd2+檢測(cè)技術(shù)具有重要的意義。

納米金(AuNPs)是尺寸在1～100 nm 的金顆粒，具有局部表面等離子共振性質(zhì)，顆粒聚集能使溶液的顏色發(fā)生裸眼可視的變化［5］。Wang A J 等人［6］、Xue Y 等人［7］、Zhang M 等人［8］分別利用小分子、縮氨酸功能化制備AuNPs 探針檢測(cè)Cd2+，選擇性不好。有報(bào)道利用DNA 修飾的AuNPs比色檢測(cè)Hg2+［9，10］，Pb2+［11，12］等重金屬離子，此方法選擇性和靈敏度更好，但對(duì)Cd2+的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文提出了一種新型的基于AuNPs 的比色傳感器檢測(cè)Cd2+。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

AuNPs 選 購(gòu) 自 Sigma－Aldrich 公 司;Cd(NO3)2，Pb(NO3)2，Cu(NO3)2及其它金屬離子的固體樣品購(gòu)自上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司;ssDNA(DNA1:5’－GGGGCAGTGC－CTCACAACCT－3’DNA2 :5’－GAAAAGTTTTGCTAACTACGA－3’DNA3:5’－TTTTTTTTTTAAAAACCCCC－3’)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻大于或等于18.3 MΩ·cm。

UV－2550 UV－Vis 紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);HT7700 型透射電子顯微鏡(日本日立公司);水浴鍋(上海普渡生化科技有限公司);佳能A640 數(shù)碼相機(jī);優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)選用的DNA1 能與Cd2+發(fā)生特異性結(jié)合［13］。參照Li D 等人［14］提出的檢測(cè)Hg2+的方法進(jìn)行改進(jìn)，將2.1 μmol/L DNA 與0.5 μmol/L Cd(NO3)2混合，85 ℃水浴加熱5 min 以防止DNA 形成雙鏈并加速DNA 與Cd2+的反應(yīng)，冷卻至室溫后加入6 nmol/L AuNPs，5 min 后再加入0.2 mol/L NaCl，20 min 后觀察溶液的顏色變化，實(shí)驗(yàn)溶劑為pH=7.4 的Tris－HCl。有Cd2+存在時(shí)，DNA1 與Cd2+特異性結(jié)合，AuNPs 暴露在鹽溶液中發(fā)生聚集;沒(méi)有Cd2+存在時(shí)，DNA 通過(guò)Au－N 鍵與AuNPs 發(fā)生非共價(jià)鍵吸附［15］，阻止AuNPs 的聚集(圖1)。

圖1 Cd2+-ssDNA 復(fù)合物介導(dǎo)AuNPs 聚集Fig 1 Cd2+-ssDNA compound mediated AuNPs gathered

2 結(jié)果與討論

2.1 NaCl 濃度的影響

比色檢測(cè)法的靈敏度與AuNPs 抗聚集能力有關(guān)，在高離子強(qiáng)度下，AuNPs 之間的靜電排斥較弱，金屬離子更容易介導(dǎo)AuNPs 聚集［16］。NaCl 濃度是使AuNPs 不穩(wěn)定的顯著因素，使其濃度最優(yōu)化，能得到更低的檢測(cè)限。圖2 插圖顯示了在DNA 與AuNPs 的混合溶液中加入不同濃度的NaCl(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mol/L)80 min 后的顏色變化，明顯看出0.4 mol/L 及以上濃度的NaCl 使AuNPs 聚集，溶液變紫。為使未添加Cd2+時(shí)溶液顏色穩(wěn)定，本文研究NaCl 濃度為0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L時(shí)，DNA－AuNPs 溶液對(duì)1 μmol/L Cd2+的反應(yīng)，記錄紫外—可見(jiàn)吸收光譜如圖2(a)所示，波峰隨著NaCl 濃度的升高而右移，在620 nm 左右出現(xiàn)新的吸收峰。利用A620/A520的比值來(lái)表示AuNPs 的聚集程度，相同濃度Cd2+條件下，A620/A520與NaCl 濃度的關(guān)系如圖2(b)所示，隨著NaCl 濃度升高，AuNPs 的聚集程度增加，直到0.2 mol/L 之后趨于穩(wěn)定，考慮到NaCl 濃度過(guò)高會(huì)影響溶液的背景顏色，本實(shí)驗(yàn)選擇0.2 mol/L 為NaCl 的最佳濃度。

圖2 NaCl 濃度的影響Fig 2 Influence of different concentrations of NaCl

2.2 靈敏度

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下(2.1 μmol/L DNA1，0.2 mol/L NaCl，pH=7.4 Tris－HCl)添加0～40 μmol/L 的Cd2+，分別培養(yǎng)20 min 后的紫外—可見(jiàn)吸收光譜記錄如圖3，隨著Cd2+濃度的升高，520 nm 左右的吸收峰逐漸減小，在640 nm 左右出現(xiàn)了新的吸收峰，且明顯的紅移。溶液的顏色由紅變藍(lán)紫，如圖3 插圖所示，Cd2+濃度為0.5 μmol/L 時(shí)開始觀察到肉眼可見(jiàn)的由紅到紫的顏色變化，證明了AuNPs 在Cd2+－DNA 復(fù)合物的介導(dǎo)下發(fā)生了聚集。

圖3 添加不同濃度Cd2+(0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2 μmol/L)的DNA-AuNPs 溶液紫外—可見(jiàn)吸收光譜和照片F(xiàn)ig 3 UV-vis spectra and photograph of DNA-AuNPs in the presence of different of Cd2+(0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2 μmol/L)

2.3 選擇性

用相同濃度的其它離子(K+，Ca2+，Co2+，Al3+，Zn2+，Cr3+，Mn2+，Cu2+，Pb2+)代替2 μmol/L Cd2+在最佳條件下實(shí)驗(yàn)，顏色變化如圖4 插圖，Cd2+溶液顏色完全變紫，Cu2+，Pb2+有輕微顏色干擾，吸光度比A640/A520看出只有添加Cd2+的溶液中AuNPs 發(fā)生聚集，Cu2+，Pb2+干擾輕微。

圖4 1 μmol/L Cd2+以及其它金屬分別得到AuNPs 的吸光度比A640/A520(培養(yǎng)時(shí)間20 min)Fig 4 The ratio of A640/A520 of AuNPs in the presence of 1 μmol/L Cd2+or other metal ions(incubation time is 20 min)

3 結(jié) 論

本文建立了一種新的基于Cd2+－DNA 復(fù)合物介導(dǎo)AuNPs 聚集檢測(cè)Cd2+的比色生物傳感器。該傳感器利用AuNPs 局部表面等離子共振性質(zhì)將化學(xué)能轉(zhuǎn)換為裸眼可見(jiàn)的光信號(hào)，并放大，最佳實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)限可低至0.5 μmol/L，且對(duì)與Cd2+性質(zhì)極其相似的Zn2+不響應(yīng)，Cu2+，Pb2+有輕微干擾。該傳感器操作簡(jiǎn)單、成本低，且十分新穎，實(shí)際應(yīng)用潛力巨大。

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