姚念玲，馬佳佳，李 佳，陳必良

sFlt-1及PI3K/AKT通路與子癇前期相關(guān)性研究

姚念玲，馬佳佳，李 佳，陳必良

目的 探討子癇前期的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中sFlt-1與PI3K/AKT通路的相關(guān)性。從細(xì)胞分子水平研究子癇前期發(fā)生發(fā)展規(guī)律，尋找有效的分子治療靶點(diǎn)。方法 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代。用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot法分別檢測sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常妊娠的HUVECs和子癇前期的HUVECs及在經(jīng)PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用的子癇前期HUVECs中的表達(dá)情況。結(jié)果 實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot結(jié)果均顯示sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常妊娠的HUVECs低表達(dá)；在子癇前期HUVECs中高表達(dá)；在LY294002作用后的子癇前期HUVECs中發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/AKT通路的同時(shí)sFlt-1的表達(dá)也發(fā)生了下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 sFlt-1可能參與子癇前期的發(fā)病過程。PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與子癇前期的病理過程，可能成為子癇前期有效的分子治療靶點(diǎn)。

子癇前期；可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1；PI3K/AKT通路；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種嚴(yán)重影響母嬰健康的產(chǎn)科重癥，是以高血壓、蛋白尿、水腫、多器官功能障礙為特征的一組疾病，發(fā)病率約為5%，病死率約為10%[1]，是圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦及胎嬰兒死亡的重要原因。因此，明確子癇前期的發(fā)病原因、機(jī)制、病理過程，病情的發(fā)展規(guī)律，找到有效的預(yù)防、治療方法尤為重要。對(duì)于子癇前期的治療，目前多以對(duì)癥治療為主，如：休息、解痙、降壓、促胎兒肺成熟等。發(fā)現(xiàn)有效的分子治療靶點(diǎn)是子癇前期目前亟待解決的臨床問題。國內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道，sFlt-1與子癇前期發(fā)病相關(guān)，可作為早期預(yù)測的分子標(biāo)志物[2]。但多數(shù)研究是從血清學(xué)或胎盤組織學(xué)方面研究，缺乏細(xì)胞分子水平的驗(yàn)證。本研究利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞探討了sFlt-1與子癇前期的相關(guān)性，及PI3K/AKT信號(hào)通路在該過程中發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意的前提下，選擇2013年9月至2014年8月第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)檢并住院分娩的子癇前期患者35例，其中初產(chǎn)婦21例，經(jīng)產(chǎn)婦14例，均為自然受孕，單活胎，分娩孕周≥37周，平均孕周(38.0±0.7)周，在孕期接受過相同的醫(yī)學(xué)指導(dǎo)及治療。最小年齡20歲，最大年齡45歲，平均年齡(31.4±6.9)歲。同時(shí)期正常妊娠分娩婦女33例，其中初產(chǎn)婦17例，經(jīng)產(chǎn)婦16例，均為自然受孕，單活胎，分娩孕周≥37周，平均孕周(38.0±0.9)周，最小年齡22歲，最大年齡41歲，平均年齡(30.3±5.7)歲。子癇前期診斷按照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版中妊娠期高血壓疾病分類之標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2 標(biāo)本采集 于產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)后立即無菌操作取臍帶，長約20 cm，輕輕擠出臍帶血管中的殘存血液，避免用力過度及反復(fù)揉搓。將其放入37 ℃含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的PBS液無菌玻璃瓶中，2 h內(nèi)進(jìn)行人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)提取及培養(yǎng)。細(xì)胞提取利用胰酶消化法。在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific 公司8000)中原代培養(yǎng)及傳代至3～4代。

1.3 樣本分組 正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs 為NP組；子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs為PE組；子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μm的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h為LY組。

1.4 方法 實(shí)時(shí)定量PCR(試劑盒購自日本TaKaRa公司)和Western-blot法(試劑盒購自美國Bioworld Technology公司)分別檢測sFlt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在NP組、PE組及LY組中的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組指標(biāo)的表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)，組間比較進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測3組sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的mRNA表達(dá) 比較3組HUVECS中sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的mRNA相對(duì)含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖1～3示。

注：NP：正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；PE：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；LY：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μm的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h。與NP及LY組比較aP<0.05圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測3組sFlt-1mRNA水平的比較

注：NP：正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；PE：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；LY：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μm的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h。與NP及LY組比較aP<0.05圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測3組PI3Kp85αmRNA水平的比較

2.2 Western-blot法檢測3組sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的蛋白表達(dá) 從實(shí)驗(yàn)得到的各組細(xì)胞Western-blot的sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)條帶圖，如圖4A、圖5A和圖6A示。利用Quantity One軟件進(jìn)行各組細(xì)胞各指標(biāo)Western條帶的灰度分析，得出灰度值，再比內(nèi)參照GAPDH基因的條帶灰度值，比較各細(xì)胞樣本的相對(duì)表達(dá)量即樣本基因灰度值/GAPDH基因灰度值。如圖4B、圖5B、圖6B示。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HUVECS中sFlt-1、PI3Kp85α、AKTp85α的表達(dá)在PE組高于LY組，而LY組又高于NP組。

注：NP：正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；PE：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；LY：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μM的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h。與NP及LY組比較aP<0.05圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測3組p-AKT(ser473)mRNA水平的比較

注：NP：正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；PE：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；LY：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μm的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h。圖A為Western-blot條帶圖，圖B為細(xì)胞樣本的相對(duì)表達(dá)量圖4 Western-blot法檢測3組sFlt-1的表達(dá)

注：NP：正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；PE：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；LY：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μm的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h。圖A為Western-blot條帶圖，圖B為細(xì)胞樣本的相對(duì)表達(dá)量圖5 Western-blot法檢測3組PI3Kp85α的表達(dá)

注：NP：正常妊娠的產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；PE：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs；LY：子癇前期產(chǎn)婦分娩獲得的HUVECs，經(jīng)50 μm的PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用2 h。圖A為Western-blot條帶圖，圖B為細(xì)胞樣本的相對(duì)表達(dá)量圖6 Western-blot法檢測3組p-AKT(ser473)的表達(dá)

3 討論

子癇前期是圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦及胎嬰兒死亡的重要原因。研究表明，子癇前期發(fā)病的一重要組織病理基礎(chǔ)可能就是缺氧造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損[4]；子宮螺旋小動(dòng)脈供血不足，胎盤著床淺，導(dǎo)致胎盤循環(huán)血流量降低，胎兒血氧供給不足[5]。子癇前期的發(fā)病源于早期滋養(yǎng)層入侵子宮內(nèi)膜時(shí)的不足，子宮螺旋動(dòng)脈重新構(gòu)建失敗。這是一個(gè)復(fù)雜的過程，與惡性腫瘤細(xì)胞的某些生物學(xué)行為極為類似。缺氧能使滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌sFlt-1增加[6]。

sFlt-1稱為可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1，是一種糖蛋白，其具有酪氨酸激酶活性，歸屬于酪氨酸激酶家族的Ⅲ型受體。sFlt-1與Flt-1都是血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)。sFlt-1是VEGF的抑制物，與Flt-1競爭結(jié)合VEGF和胎盤生長因子(PLGF)，使其生物學(xué)活性被完全阻斷，引起血管生成不良，發(fā)揮抑制血管生成的作用，同時(shí)造成血管壁的完整性及通透性損傷。VEGF和sFlt-1都是缺氧敏感，受缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的調(diào)控，均屬于缺氧反應(yīng)基因[7]。誘導(dǎo)母胎界面 sFlt-1 表達(dá)的重要因素就是低氧[8]。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)家族成員屬于原癌基因，是一種胞內(nèi)磷脂酞肌醇激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B(AKT)是PI3K下游分子，兩者所組成的信號(hào)通路PI3K/AKT 信號(hào)通路與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如：高血壓、糖尿病、惡性腫瘤等。PI3K經(jīng)過一系列的磷酸化過程激活其下游分子AKT，AKT 又通過直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、哺乳類動(dòng)物雷帕霉素(mTOR)等，參與和調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)過程。研究發(fā)現(xiàn)該通路與人類血管性、代謝性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后密切相關(guān)[9]。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活, 其活性異常能影響腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成，目前不少腫瘤的分子靶點(diǎn)治療都涉及到了PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，并已成為熱點(diǎn)課題[10]。

臍帶是母胎屏障的重要組成部分，行使著母胎間物質(zhì)交換的作用，子癇前期的病理變化在臍帶中都會(huì)表現(xiàn)。臍靜脈是臍帶中最粗大的血管，又具備動(dòng)脈特性，是研究子癇前期血管因素理想載體。在本實(shí)驗(yàn)中筆者選取了HUVECs作為研究對(duì)象，利用Western-blot法檢測了正常妊娠分娩(NP組)和子癇前期分娩(PE組)的HUVECs中sFlt-1、PI3Kp85α、p-AKT(ser473)的相對(duì)表達(dá)。觀察數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，子癇前期時(shí)3因子蛋白表達(dá)均數(shù)都升高，推測子癇前期可能刺激了sFlt-1的分泌，激活了PI3K/AKT通路。用LY294002(PI3K/AKT通路特異性抑制劑)作用子癇前期的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，3個(gè)因子均下調(diào)。最后通過3樣本間的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到sFlt-1、PI3Kp85α和p-AKT(ser473)在3組表達(dá)有差異，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此得出結(jié)論：子癇前期時(shí)sFlt-1和PI3K/AKT通路的蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制PI3K/AKT通路可使sFlt-1的表達(dá)也同時(shí)下調(diào)。說明sFlt-1與PI3K/AKT通路間在子癇前期時(shí)存在密切聯(lián)系。

LY294002是目前廣泛應(yīng)用的PI3K通路特異性抑制劑，通過特異性抑制PI3Kpllo亞單位的催化活性，阻礙下游底物PIP3的生成，使該通路處于失活狀態(tài)[11]。許多學(xué)者已經(jīng)將PI3K/AKT通路的抑制用于腫瘤治療的研究。子癇前期的治療是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的難題。絕大多數(shù)是對(duì)癥治療或是終止妊娠。但母胎間存在著利益沖突，為了母體的健康過早地結(jié)束妊娠可能對(duì)胎兒造成很大威脅，甚至死亡。因此，學(xué)者們一直在為尋找最安全、最有效的治療方法而不懈努力。臨床工作中大多數(shù)情況下是在對(duì)癥治療的情況下采取期待療法。許多治療方法已應(yīng)用到了臨床，如休息，鎮(zhèn)靜，解痙，降壓，促胎兒肺成熟治療，拉貝洛爾、硫酸鎂、低分子肝素、小劑量阿司匹林等藥物的應(yīng)用[12-14]。但這些均為針對(duì)緩解癥狀的治療，治標(biāo)不治本。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sFlt-1可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路誘發(fā)子癇前期的發(fā)病、病理過程，這可能成為子癇前期新的分子治療靶點(diǎn)。

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(本文編輯：莫琳芳)

Study on the correlation between sFlt-1 and PI3K/AKT pathway in preeclampsia

YaoNianling,MaJiajia,LiJia,ChenBiliang

(DepartmentofObstetricsandGynecology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,CPLA，Xi′an710032,China)

Objective To explore the correlation between sFlt-1 and PI3K/AKT pathway in the umbilical vein endothelial cells in preeclampsia, and also to investigate the incidence and development of preeclampsia from the molecular standpoint, so as to find out effective treatment target of the disorder.Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were cultured in vitro and developed into the next generation. The expression levels of sFlt-1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) in HUVECs of normal pregnancy, preeclampsia HUVECs, as well as preeclampsia HUVECs through the access of PI3K/AKT pathway inhibitor—LY294002, were detected respectively by real time quantitative PCR and Western blot.Results Detection results indicated that there were low expressions of sFlt- 1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) in the HUVECs of normal pregnancy, but there were high expressions of preeclampsia HUVECs. Following the inhibition by LY294002, the level of preeclampsia HUVECs revealed that the expression level of sFlt-1 was also down-regulated, with the blocking of PI3K/AKT pathway (P<0.05). Statistical significance could be noticed, when comparisons were made between them.Conclusion There were igh expressions of sFlt-1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) in the patients with preeclampsia in HUVECs of in vitro primary culture, indicating that sFlt-1 might be involved in the pathogenesis of preeclampsia. With the inhibition of preeclampsia HUVECs by LY294002, the expression levels of sFlt-1, PI3Kp85α and p-AKT (ser473) were all down-regulated, indicating that PI3K/AKT signal pathway might be involved in the pathogenesis of preeclampsia. It might be the effective molecular treatment target for preeclampsia.

Preeclampsia; sFlt-1; PI3K/AKT pathway; Human umbilical vein endothelial cell

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科

R714.24

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2015.05.017

2015-06-30)