王曉來(lái)，孫子林

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

高糖高脂喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠動(dòng)脈鈣化的研究

王曉來(lái)，孫子林

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210009)

目的:研究高糖、高脂喂養(yǎng)LDL受體基因缺陷(LDLR-/-)小鼠的代謝及血管鈣化指標(biāo)，探討糖尿病血管鈣化的相關(guān)機(jī)制。方法：高糖、高脂喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組(HF組)，常規(guī)飼養(yǎng)LDLR-/-小鼠為對(duì)照組(CON組)，喂養(yǎng)16周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束檢測(cè)兩組小鼠空腹血糖(FBS)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹胰島素(FIns)。流動(dòng)注射分析法檢測(cè)血清糖基化終產(chǎn)物肽(AGE-P)，實(shí)時(shí)定量PCR分析小鼠主動(dòng)脈MSX2、OPN、Cbfα-1、α-SMA mRNA表達(dá)，蘇木精-伊紅染色法(HE染色)觀察主動(dòng)脈粥樣硬化病變，Von Kossa染色觀察主動(dòng)脈鈣化病變。結(jié)果：與CON組比較，HF組小鼠血清FBS、FIns、穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)、CHO、TG、LDL、HDL、AGE-P水平顯著增高；HF組小鼠主動(dòng)脈MSX2、OPN、Cbfα-1基因表達(dá)增加，α-SMA基因表達(dá)減少。光鏡下觀察，HE染色CON組主動(dòng)脈未見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化病變，HF組主動(dòng)脈可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化。Von Kossa染色CON組主動(dòng)脈未見(jiàn)鈣化，HF組主動(dòng)脈可見(jiàn)鈣化。結(jié)論：高糖、高脂喂養(yǎng)可以加重LDLR-/-小鼠糖、脂代謝異常，繼而加速動(dòng)脈鈣化。這一動(dòng)物模型可用于糖尿病相關(guān)血管鈣化的研究。

動(dòng)脈鈣化； 低密度脂蛋白受體基因缺陷小鼠； 糖尿病

既往認(rèn)為血管鈣化是一個(gè)被動(dòng)的、衰退的過(guò)程，但是近期多項(xiàng)研究顯示其是主動(dòng)的、可被調(diào)節(jié)的過(guò)程，這是一個(gè)病理生理過(guò)程，同時(shí)具有胚胎期骨形成的一些特點(diǎn)。研究證實(shí)血管鈣化可通過(guò)多種疾病過(guò)程如高血壓、心肌梗死、心臟肥大、充血性心力衰竭、動(dòng)脈狹窄、肢端缺血等危害血管壁并破壞其完整性，從而降低動(dòng)脈、大動(dòng)脈的彈性，并影響循環(huán)系統(tǒng)的血流動(dòng)力學(xué)，使患者心血管疾病的發(fā)病率和死亡率明顯增加[1-3]。研究顯示冠狀動(dòng)脈鈣化積分可用于預(yù)測(cè)未來(lái)心血管不良事件發(fā)生率[4-6]。深入性研究顯示，糖尿病患者的冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生率更高，且與脂代謝異常、胰島素抵抗及其他的心血管疾病危險(xiǎn)因素相關(guān)[7-11]。

LDL受體基因缺陷(LDLR-/-)小鼠是1993年Ishibashi等采用基因工程技術(shù)從胚胎干細(xì)胞中建立的小鼠模型。純合子小鼠血清膽固醇水平很高，當(dāng)給小鼠喂高脂飲食時(shí)，可達(dá)到大于2 000 mg·dl-1，而正常小鼠血清膽固醇為80～100 mg·dl-1。雖常規(guī)飲食飼養(yǎng)無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化生成，但它有別于單純飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠模型，前者動(dòng)脈粥樣硬化病變具有延展性，且與載脂蛋白E基因缺陷小鼠比較，LDLR-/-小鼠脂蛋白譜更近似于人類。

本研究旨在通過(guò)研究高糖、高脂喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠的代謝及血管鈣化指標(biāo)，探討糖尿病相關(guān)血管鈣化的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

12周齡雄性LDLR-/-小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(蘇)2005-0002。常規(guī)飼料及高糖、高脂飼料購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，高糖、高脂飼料成分為基礎(chǔ)飼料59.8%、豬油16%、蔗糖20%、蛋黃3%、膽固醇1%、膽鹽0.2%。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組 12周齡SPF級(jí)雄性LDLR-/-小鼠經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為常規(guī)飼料喂養(yǎng)組即對(duì)照組(CON組，n=10)，高糖、高脂飼料喂養(yǎng)組即實(shí)驗(yàn)組(HF組，n=10)。CON組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，HF組給予高糖、高脂飼料喂養(yǎng)，分別喂養(yǎng)16周。

1.2.2處死及血液組織標(biāo)本取材 實(shí)驗(yàn)第16周末兩組LDLR-/-小鼠禁食8 h以上，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉，每只小鼠經(jīng)摘取眼球取血標(biāo)本，斷頸處死小鼠并摘取升主動(dòng)脈至胸主動(dòng)脈段，將標(biāo)本一部分即刻提取mRNA，一部分放入4%多聚甲醛中固定，以制備石蠟切片。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清空腹血糖(FBS)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)，放免法檢測(cè)血清空腹胰島素(Fins)水平，通過(guò)公式計(jì)算穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)(HOMA-IR)，公式如下：HOMA-IR=FIns(μIu·L-1)×FBS(mmol·L-1)÷22.5。

1.2.4流動(dòng)注射分析法檢測(cè)血清糖基化終產(chǎn)物肽(AGE-P) 取小鼠血清20 μl加入480 μl三氯醋酸(0.15 mol·L-1)的EP管，并加入100 μl氯仿，劇烈振蕩后將脂質(zhì)抽提入有機(jī)相，離心10 min。吸取水層20 μl注入高效液相色譜儀進(jìn)樣環(huán)，流動(dòng)相流動(dòng)速率穩(wěn)定在0.5 ml·min-1，紫外檢測(cè)器設(shè)定波長(zhǎng)280 nm測(cè)定肽的含量，熒光檢測(cè)器設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)440 nm測(cè)定AGE-P含量。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR分析 Trizol提取組織RNA，按照Prime Script RT reagent試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用特異性引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR。擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，33個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，以2-ΔΔCt法對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)HF組-(Ct目的基因-Ct管家基因)CON組。用于基因序列擴(kuò)增的引物序列見(jiàn)表1。

表1 用于基因序列擴(kuò)增的引物序列

注:GAPDH為磷酸甘油醛脫氫酶，MSX2為成骨轉(zhuǎn)錄因子，OPN為骨橋蛋白，α-SMA為平滑肌肌動(dòng)蛋白，Cbfα-1為核心結(jié)合因子α-1

1.2.6蘇木精-伊紅染色法(HE)染色 兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈石蠟切片經(jīng)常規(guī)HE染色后于光鏡下觀察組織學(xué)特點(diǎn)。

1.2.7Von Kossa染色 兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈石蠟切片脫蠟至水化，蒸餾水沖洗后將切片浸入2%硝酸銀溶液中，強(qiáng)光直射20～60 min后蒸餾水充分洗滌，再將切片浸入2.5%硫代硫酸鈉溶液中1 min，蒸餾水反復(fù)洗滌充分后放入1%伊紅溶液復(fù)染約數(shù)秒鐘，蒸餾水洗滌充分。常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)比較，如方差齊采用t檢驗(yàn),如方差不齊采用t′檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束兩組LDLR-/-小鼠的代謝指標(biāo)檢測(cè)

見(jiàn)表2、3。

表2 兩組LDLR-/-小鼠的體重、FBS、FIns、HOMA-IR比較

a 與CON組比較，P<0.05

表3 兩組LDLR-/-小鼠的血脂比較

a 與CON組比較，P<0.05

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束兩組LDLR-/-小鼠血清AGE-P檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈MSX2、OPN、Cbfα-1、α-SMA mRNA的表達(dá)見(jiàn)表5。

表4 兩組LDLR-/-小鼠的血清AGE-P比較

a 與CON組比較，P<0.05

表5 兩組LDLR-/-小鼠各指標(biāo)的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果

a 與CON組比較，P<0.05

2.4 光鏡下兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈石蠟切片HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 光鏡下兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈石蠟切片Von Kossa染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 討 論

LDLR-/-小鼠是1993年Ishibashi等采用基因工程技術(shù)從胚胎干細(xì)胞中建立的小鼠模型。本研究選用基于C57BL/6小鼠為母本(野型)敲除LDLR-/-的小鼠。該小鼠與ApoE基因缺陷小鼠相比，脂蛋白譜更近似于人類，有利于將脂蛋白改變與人類動(dòng)脈粥樣硬化與高脂血癥的關(guān)系進(jìn)行推演；有助于觀察藥物干預(yù)后分析動(dòng)脈粥樣硬化與高脂血癥以及兩者導(dǎo)致的心血管病理改變?nèi)缧难茆}化的臨床意義。

CON組動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈長(zhǎng)形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)呈嗜酸性紅染。HF組內(nèi)膜不完整，內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞，并伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)成分的增殖，可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊。箭頭所指為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊

圖1 兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈HE染色 ×200

CON組為陰性，未見(jiàn)鈣化。HF組可見(jiàn)黑褐色的鈣鹽呈顆粒狀至斑塊狀沉積于血管平滑肌層。箭頭所指為顆粒狀至斑塊狀沉積的鈣鹽

圖2 兩組LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈Von Kossa染色結(jié)果 ×100

本研究發(fā)現(xiàn)，與CON組比較，HF組小鼠血清FBS、FIns、HOMA-IR、CHO、TG、LDL、HDL、AGE-P水平均顯著增高。與LDLR-/-小鼠的遺傳背景及喂養(yǎng)高糖高脂飼料相關(guān)。與CON組比較，HF組小鼠主動(dòng)脈MSX2、OPN、Cbfα-1的基因表達(dá)增加，α-SMA基因表達(dá)減少。既往研究顯示,在血管鈣化過(guò)程中血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，由正常的表達(dá)α-SMA的收縮型向表達(dá)MSX2、OPN、Cbfα-1的成骨型轉(zhuǎn)化，從而啟動(dòng)細(xì)胞的鈣化程序。在本研究中顯示與上述相同的表現(xiàn)，提示高糖高脂飼料喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠可誘導(dǎo)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變參與血管鈣化形成。光鏡下觀察，HE染色CON組主動(dòng)脈未見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化病變，HF組主動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。本研究顯示LDLR-/-小鼠存在糖、脂代謝及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的異常，在高糖高脂飼料的誘導(dǎo)作用下可以自發(fā)地發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，這與以往的研究結(jié)果相一致[12]。Von Kossa染色顯示CON組主動(dòng)脈無(wú)鈣化，HF組主動(dòng)脈中層發(fā)生鈣化。提示高糖、高脂喂養(yǎng)可以誘導(dǎo)LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈鈣化，該結(jié)果與HF組存在嚴(yán)重糖、脂代謝紊亂有關(guān)。

糖尿病與血管鈣化的發(fā)生密切相關(guān)。2型糖尿病患者普遍存在脂代謝紊亂，有研究顯示糖尿病患者治療前即存在TG、LDL升高[13]。隨著糖尿病患病時(shí)間的延長(zhǎng)，胰島素抵抗及糖毒性、脂毒性對(duì)β細(xì)胞的損害可加重胰島素分泌功能進(jìn)行性減退。本研究中的動(dòng)物模型符合2型糖尿病的上述特點(diǎn)，因?yàn)樵谔悄虿〉陌l(fā)生、發(fā)展過(guò)程中同時(shí)存在著高血糖、AGE升高、肥胖、氧化應(yīng)激、高胰島素血癥、炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂、骨調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常、細(xì)胞凋亡、脂肪因子、糖尿病腎病等多種病理過(guò)程，而上述情況可能直接或間接促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展[14-21]。對(duì)于糖尿病動(dòng)物模型的血管鈣化相關(guān)指標(biāo)的研究，有助于探索防治糖尿病相關(guān)血管鈣化的措施。綜上，高糖、高脂喂養(yǎng)可以加重LDLR-/-小鼠糖、脂代謝異常，繼而加速動(dòng)脈鈣化，這一動(dòng)物模型可以用于糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥機(jī)制的研究。糖尿病相關(guān)血管鈣化的機(jī)制尚需更深入的研究證實(shí)。

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High-sugar，high-fat diet induced aortic calcification in low density lipoprotein receptor gene deficient mice

WANG Xiao-lai，SUN Zi-lin

(DepartmentofEndocrinology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To explore the mechanisms of diabetic vascular calcification by studying the indicators of metabolism and vascular calcification in the high-sugar， high-fat diet low density lipoprotein receptor gene deficient (LDLR-/-) mice. Methods: High-sugar， high-fat diet fed LDLR-/-mice was the experimental group (HF group) and conventional diet fed LDLR-/-mice was the control group (CON group). The two groups were fed for 16 weeks. At the end of the experiment， fasting blood glucose (FBS)， total cholesterol (CHO)， triglyceride (TG)， low density lipoprotein (LDL)， high density lipoprotein (HDL)， fasting insulin (FIns) were detected. Serum advanced glycation end product-peptide (AGE-P) were detected by flow injection analysis. The expressions of MSX2， OPN， Cbfα-1，α-SMA mRNA were analyzed by Real-time quantitative PCR. Aortic atherosclerotic lesions were observed by hematoxylin-eosin staining. Aortic calcified lesions were observed by Von Kossa staining. Results: Compared with CON group，the serum FBS， FIns， HOMA-IR， CHO， TG， LDL， HDL， AGE-P were significantly higher in HF group. The gene expressions of MSX2， OPN， Cbfα-1 increased， whileα-SMA decreased. Aortic atherosclerotic lesions were seen in HF group. HF group demonstrated aortic calcification by Von Kossa staining. No aortic calcification was showed in the CON group. Conclusion: The high sugar， high fat diet can increase the metabolism disorder of glucose and lipid in the LDLR-/-mice， and then accelerate aortic calcification. This animal model can be used to study the mechanisms of vascular complications associated with diabetes.

aortic calcification; low density lipoprotein receptor gene knock-out mice; diabetes

2015-04-15

2015-05-02

王曉來(lái)(1975-)，女，遼寧丹東人，副主任醫(yī)師，在讀博士研究生。E-mail:xiaolai75@163.com

孫子林 E-mail:sunzilin@hotmail.com

王曉來(lái),孫子林.高糖高脂喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠動(dòng)脈鈣化的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):577-582.

R587.1； R-33

A

1671-6264(2015)04-0577-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．017