劉萬，鄭倩倩，華子春，張晶

(南京大學(xué)生命科學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 南京 210093)

·論 著·

凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)對肺癌細胞增殖遷移的影響

劉萬，鄭倩倩，華子春，張晶

(南京大學(xué)生命科學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 南京 210093)

目的:近來凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)作為新的抗腫瘤治療靶點受到關(guān)注，為了探討c-FLIP(L)在肺癌細胞遷移中的作用，我們建立了c-FLIP(L)高表達穩(wěn)定細胞株，以比較c-FLIP(L)在肺癌細胞株中表達水平與其細胞遷移能力的關(guān)系。方法：采用非小細胞肺癌A549細胞株進行轉(zhuǎn)染c-FLIP(L)真核表達質(zhì)粒，通過G418篩選出多株c-FLIP(L)高表達單克隆，以此為平臺研究c-FLIP(L)在腫瘤細胞遷移過程中的作用。通過實時熒光定量QPCR及Western Blot檢測穩(wěn)定株中c-FLIP(L)表達水平；劃痕實驗及Transwell法檢測c-FLIP(L)高表達對肺癌細胞遷移的影響，并通過熒光骨架蛋白染色觀察細胞形態(tài)的改變。結(jié)果：QPCR和Western Blot顯示A549穩(wěn)定細胞株中c-FLIP(L)均為高表達；Wound healing和Transwell實驗表明c-FLIP(L)高表達肺癌細胞遷移能力明顯上升，并初步探索了c-FLIP(L)表達對細胞骨架的影響。結(jié)論：凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)的高表達能促進肺癌A549細胞的遷移。

肺癌； 凋亡抑制蛋白； c-FLIP(L)； 腫瘤遷移

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率占所有惡性腫瘤的第1位，女性肺癌發(fā)病率和死亡率占第2位[1]。肺癌細胞遷移是惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵步驟，也是導(dǎo)致患者手術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡的主要原因，目前針對肺癌轉(zhuǎn)移的研究至今尚不完全明確。

c-FLIP(L)是一種重要的凋亡抑制蛋白，作為caspase-8結(jié)構(gòu)同源類似物，通過自身的DEDs結(jié)構(gòu)域競爭性結(jié)合凋亡接頭蛋白FADD來抑制caspase-8的激活，發(fā)揮凋亡抑制作用[2]。近幾年，相關(guān)文獻報道了c-FLIP(L)除了抗凋亡功能外，還參與很多生理或病理過程并發(fā)揮多種重要作用，如促進細胞增殖、影響細胞壞死等[3-5]。腫瘤細胞的增殖失控、分化異常以及具有遷移和浸潤能力是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，特別是腫瘤細胞的遷移和浸潤對抗腫瘤治療有十分重要的意義。目前發(fā)現(xiàn)幾乎所有的腫瘤細胞中c-FLIP(L)的表達水平都升高，c-FLIP(L)已經(jīng)成為抗腫瘤的靶點越來越被重視[6]。為此，我們建立了多株c-FLIP(L)高表達肺癌細胞株，以此為平臺初步探討c-FLIP(L)在腫瘤中遷移和浸潤中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細胞A549由本實驗室凍存，質(zhì)粒pCDNA3.1和pCDNA3.1-FLIP均來自Dr.JK Zhang(Kimmel Cancer Center，USA)贈與，TRIzol購自Ambion公司，真核轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，Transwell小室購自Corning公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Wisent公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自諾唯贊公司,抗體β-actin購自華安生物公司，抗體c-FLIP(L)購自Cell signaling，骨架染料Texas Red-X phalloidin(T7471)購自invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染以及單克隆穩(wěn)定株的篩選 人肺癌細胞A549培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于體積分數(shù)為5% CO2細胞箱中37 ℃培養(yǎng)。當(dāng)細胞培養(yǎng)到貼壁密度達到70%～80%時對細胞進行轉(zhuǎn)染，設(shè)為對照組(轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空載質(zhì)粒)和實驗組(轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-FLIP質(zhì)粒)，按照轉(zhuǎn)染說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后加入G418(800 mg·L-1)篩選，約2周左右獲得多克隆穩(wěn)定株進行96孔板稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)獲得陽性單克隆，再用含200 mg·L-1G418的培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達FLIP的單克隆穩(wěn)定株，凍存。

1.2.2實時熒光定量PCR(QPCR) 獲取A549細胞提取總RNA，根據(jù)RT試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取上述cDNA作為模板進行PCR擴增，引物序列如下：GAPDH：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′(Forward)和5′-GCAGGAGGCATTGCTGAT-3′(Reverse)；c-FLIP(L):5′-AATTCAAGGCCAGAAGCGA-3′(Forward)和5′-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3′(Reverse)。RT-PCR反應(yīng)條件為：高溫變性階段(95 ℃，10 min)；循環(huán)擴增階段(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min)共40個循環(huán)；溶解曲線階段(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s)。采用1.5%的瓊脂凝膠電泳驗證擴增的特異性。QPCR儀器購自AB公司，根據(jù)說明書操作，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果用2-△△Ct法計算。

1.2.3Western Blot分析 收集細胞用預(yù)冷PBS洗滌兩次，加入RIPA液(碧云天，編號P0013)進行裂解細胞，冰上放置20 min后12 000 r·min-1離心10 min，收集上清?？既痉ㄟM行蛋白質(zhì)定量后加入4×loading buffer混勻，煮沸5 min。采用10%濃度SDS-PAGE凝膠，取適量上述樣品點樣，接通電源，按照堆積膠80 V、分離膠120 V恒壓電泳。待電泳完畢進行濕轉(zhuǎn)，4 ℃下300 mA恒流電轉(zhuǎn)1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，5%脫脂奶粉液室溫下封閉1 h，然后包被一抗溶液4 ℃過夜。次日PBST洗膜4次，每次5 min，包被二抗溶液室溫1 h，PBST洗滌后滴加增強化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液孵育2 min，采用蛋白分析儀器拍攝后進行結(jié)果分析[7]。

1.2.4Transwell細胞遷移實驗 待細胞生長至貼壁80%時PBS洗2遍，用無血清培養(yǎng)液將細胞饑餓過夜。次日胰酶消化細胞，加完全培養(yǎng)液終止胰酶作用，離心去除后加入無血清培養(yǎng)液重懸，細胞計數(shù)調(diào)整密度至1×106ml-1，取100 μl細胞懸液加入Transwll板的上室，下室加入800 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)細胞遷移，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)4 h。用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)未穿膜的細胞，PBS洗3次，用4%的多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min后用熒光顯微鏡(×400)拍攝觀察穿膜的細胞。使用33% HAc 100 μl吹洗小室，至完全溶解結(jié)晶紫后進行酶標儀570 nm定量分析。

1.2.5Wound healing實驗 A549細胞接種24孔板長滿后用200 μl移液器槍頭在培養(yǎng)板底部劃“一”字形劃痕，PBS漂洗貼壁細胞，棄去漂浮細胞后加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并于此后0、24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕相對寬度并拍照，多個視野進行記錄。

2 結(jié) 果

2.1 c-FLIP(L)穩(wěn)定細胞株的鑒定

A549肺癌細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLIP表達載體后，經(jīng)過96孔板稀釋及G418篩選獲得數(shù)個具有G418抗性的A549細胞單克隆株，其中兩株編號為克隆1#和克隆2#，與對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1進行表達驗證。QPCR結(jié)果顯示，單克隆株克隆1#和克隆2#中c-FLIP(L)mRNA表達水平較對照組明顯上升(圖1)。進一步采用Western Blot檢測c-FLIP(L)蛋白質(zhì)水平，結(jié)果與QPCR一致，穩(wěn)定株克隆1#和克隆2#中c-FLIP(L)蛋白水平也明顯增加(圖2)，說明我們成功獲得了c-FLIP(L)高表達的A549穩(wěn)定細胞株。

con表示對照組，1#和2#為c-FLIP(L)單克隆株

圖1 定量PCR驗證c-FLIP(L) mRNA表達水平

Fig 1 The expression of c-FLIP(L) mRNA detected by QPCR

con為對照組，1#和2#為c-FLIP(L)單克隆株

圖2 蛋白印跡法驗證c-FLIP(L)蛋白表達水平

Fig 2 The protein expression of c-FLIP(L) detected by Western Blot

2.2 c-FLIP(L)高表達對A549細胞遷移能力的影響

為了探討c-FLIP(L)對腫瘤遷移的影響，我們分別進行了劃痕實驗和Transwell實驗，比較c-FLIP(L)高表達株與野生型對照株之間的差異。結(jié)果如圖3A顯示，c-FLIP(L)高表達能夠促進腫瘤細胞的遷移數(shù)量顯著增加，經(jīng)醋酸溶解結(jié)晶紫后酶標儀定量檢測結(jié)果如圖3B，隨著c-FLIP(L)表達量增加(2#>1#>con，圖1、2)，腫瘤細胞的遷移量也增加，呈正相關(guān)性。在劃痕實驗中檢測肺癌細胞遷移能力的變化，與對照株相比，c-FLIP(L)穩(wěn)定表達株也表現(xiàn)為遷移能力明顯增強(圖4)。這些結(jié)果提示，c-FLIP(L)具有促進肺癌細胞遷移的作用。

2.3 c-FLIP(L)表達對細胞骨架結(jié)構(gòu)的影響

癌細胞的活躍運動能力主要來自于肌動蛋白等骨架蛋白的狀態(tài)，骨架的變化不僅在細胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，還為衡量惡性腫瘤細胞生物學(xué)行為提供結(jié)構(gòu)性標志[8]。采用鬼筆環(huán)肽(Texas Red-X)熒光染料進行細胞微絲特異性染色，如圖5結(jié)果顯示：對照細胞內(nèi)微絲骨架比較完整，有正常微絲束的形成，而c-FLIP(L)穩(wěn)定細胞株胞內(nèi)微絲的完善程度差，彌散不能呈束狀，但細胞邊緣偽足狀態(tài)明顯，提示了c-FLIP(L)表達可能導(dǎo)致微絲骨架組裝的改變與腫瘤遷移能力相關(guān)。

3 討 論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見高發(fā)的惡性腫瘤之一，其前期診斷困難，擴散快，一旦確診大部分已轉(zhuǎn)移喪失治療機會，而放療和化療一直無重大突破，所以迫切需要尋找新的治療手段和治療靶點。據(jù)統(tǒng)計90%腫瘤患者的死亡由腫瘤轉(zhuǎn)移引起，是腫瘤患者臨床致死的主要原因，所以針對腫瘤轉(zhuǎn)移的研究工作顯得非常重要。

隨著腫瘤治療研究的深入，c-FLIP(L)作為重要的靶蛋白越來越被重視，除了c-FLIP(L)抗凋亡功能直接與腫瘤治療相關(guān)以外，c-FLIP(L)還參與細胞增殖，激活NF-κB、ERK/AP-1及β-catenin等途徑，為細胞生存提供多重保護[9-10]。有研究表明，惡性程度越高的腫瘤細胞中c-FLIP(L)的表達量越大，以黑色素瘤為例，c-FLIP(L)在高轉(zhuǎn)移黑色素瘤細胞株B16F10中的表達明顯高于低轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞B16F1，這意味著c-FLIP(L)的表達對腫瘤轉(zhuǎn)移可能有促進作用。為了研究c-FLIP(L)與腫瘤遷移相關(guān)性，我們先篩選建立了c-FLIP(L)穩(wěn)定表達株，在此基礎(chǔ)上確認了c-FLIP(L)的表達參與并促進腫瘤細胞遷移，并初步探索了可能的原因，為后期深入進行分子機制研究提供了良好的平臺。

a.A549對照株和穩(wěn)定株用無血清饑餓過夜，次日胰酶消化后計數(shù)，接種相同數(shù)量細胞(1×105個)加入內(nèi)室(無血清培養(yǎng)液)，外室采用10%胎牛血清完全培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)，4 h后拍照; B.上述樣品用醋酸溶解結(jié)晶紫后檢測OD570 nm的吸收值

圖3 Transwell實驗顯示c-FLIP(L)穩(wěn)定株遷移能力顯著增強

Fig 3 c-FLIP(L) enhanced cell migration determined by Transwell assay

A549穩(wěn)定株和對照株接種于24孔板，待其長滿后進行刮痕，洗滌脫落細胞后加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于0、24 h拍照

圖4 劃痕實驗證明c-FLIP(L)表達明顯促進“傷口愈合”

Fig 4 c-FLIP(L) promoted cell migration detected by wound healing assay

采用鬼筆環(huán)肽對細胞骨架微絲染色，DAPI對細胞核染色

圖5 c-FLIP表達影響細胞微絲骨架結(jié)構(gòu)

Fig 5 The cytoskeleton by Texas Red-X staining in A549 cells

本研究中，我們獲得了多株c-FLIP(L)不同程度的高表達肺癌細胞穩(wěn)定株，通過劃痕實驗和Transwell實驗分別驗證了c-FLIP(L)的表達水平與腫瘤細胞的遷移密切相關(guān)，并呈正相關(guān)，隨著c-FLIP(L)表達量的增加，A549細胞的遷移能力明顯增強，這一結(jié)果有力地說明c-FLIP(L)確實參與腫瘤細胞遷移過程，但其作用機制尚不清楚。我們初步考察了與腫瘤遷移密切相關(guān)的細胞骨架是否發(fā)生改變，因為微絲骨架的組裝完善程度與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈負相關(guān)，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。通過熒光染色比較A549對照株與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的骨架差異，可以明顯看出c-FLIP(L)穩(wěn)定表達株胞內(nèi)微絲束消失，表現(xiàn)為彌散狀，結(jié)構(gòu)遭破壞，而細胞邊緣偽足狀微絲增加，有利于細胞遷移。骨架的異常改變?yōu)槟[瘤遷移提供基礎(chǔ)，c-FLIP(L)是否通過改變骨架結(jié)構(gòu)促使腫瘤細胞獲得遷移能力？后期我們將圍繞這一可能進一步開展研究。全面了解c-FLIP(L)在腫瘤遷移中的作用及其機制，加深對腫瘤遷移機制的探索，在為臨床防治腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路和方法上具有重要意義。

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The effect of cellular FLICE-like inhibitory protein(c-FLIP(L))on cell migration in lung cancer cell

LIU Wan，ZHENG Qian-qian，HUA Zi-chun，ZHANG Jing

(StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology，CollegeofLifeSciences，NanjingUniversity，Nanjing210093，China)

Objective： Cellular FLICE-like inhibitory protein (c-FLIP(L)) is an important target for cancer therapy. In this study， we established stable cell line in A549 overexpressing c-FLIP(L) and to examine the potential role of c-FLIP(L) in migration of lung cancer cells. Methods: A549 cells was transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-FLIP and then selected with G418. Expressions of c-FLIP(L) in stable cells were detected by QPCR and Western Blot. The effect of c-FLIP(L) on cell migration was determined using Would healing and Transwell assays， respectively. Results： c-FLIP(L) was successfully highly expressed in A549 stable cells， and increased expression of c-FLIP(L) significantly promoted cell migration testified by Wound healing and Transwell assay. Conclusion: c-FLIP(L) is upregualted in A549 cells relative to the migration ability. This finding is helpful for exploring the molecular mechanism of metastasis in lung cancer cells．

lung cancer; inhibitor of apoptosis protein; cellular FLICE-like; tumor migration

2015-03-09

2015-04-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(31071196)

劉萬(1992-)，男，安徽安慶人，在讀碩士研究生。E-mail:1019034894@qq.com

張晶 E-mail:jzhang08@nju.edu.cn

劉萬,鄭倩倩,華子春,等.凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)對肺癌細胞增殖遷移的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):536-540.

R734.2； R318

A

1671-6264(2015)04-0536-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．009