沈旭,蔣贊利,吳小濤,張曉峰,謝鑫薈,肖倩茹,黃寧平,王野

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210009； 2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

PHBV納米纖維對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)影響

沈旭1,蔣贊利1,吳小濤1,張曉峰2,謝鑫薈1,肖倩茹2,黃寧平2,王野1

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210009； 2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的：探究聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)納米材料對大鼠間充質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，為PHBV納米材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)聯(lián)合移植治療脊髓損傷提供新的依據(jù)。方法：采用貼壁分離培養(yǎng)的方法分離純化大鼠BMSC，傳至3～4代后接種至PHBV納米纖維膜(定向與非定向)上，以接種至玻片上為對照組，倒置顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞與PHBV納米纖維膜融合(24 h)后，以維甲酸(RA)作為增殖及分化誘導(dǎo)因子對BMSCs進(jìn)行增殖培養(yǎng)、分化誘導(dǎo)，1周后，實驗組采用4%多聚甲醛固定，應(yīng)用電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用Nestin抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。結(jié)果：BMSCs與PHBV納米纖維膜有很好的相容性，加入RA誘導(dǎo)劑72 h 后細(xì)胞形態(tài)開始變化，胞體開始回縮，突起逐漸伸出。電鏡觀察下定向PHBV組的神經(jīng)元樣細(xì)胞被顯著拉長，并且細(xì)胞沿定向纖維的方向伸展，非定向PHBV組與對照組的神經(jīng)細(xì)胞則無明顯的拉長狀態(tài)。免疫熒光染色驗證均有Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)。結(jié)論：定向納米纖維通過引導(dǎo)細(xì)胞骨架延伸從而對細(xì)胞形貌產(chǎn)生顯著影響。與非定向納米纖維相比，神經(jīng)元樣細(xì)胞在定向納米纖維表面被顯著拉長。因此，我們認(rèn)為定向納米纖維支架可能在神經(jīng)組織工程中更有優(yōu)勢。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 聚羥基丁酸戊酸共聚酯納米材料； 神經(jīng)干細(xì)胞; 大鼠

聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)是聚羥基丁酸和聚羥基戊酸的共聚物，它在生物體內(nèi)主要作為細(xì)胞的碳源和能源的貯存物質(zhì)，具有生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性、修復(fù)骨缺損等許多優(yōu)良特性[1]。除生物活性支架外，組織工程中另一個重要的挑戰(zhàn)就是種子細(xì)胞的選擇。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞,具有多向分化潛能[2]。研究表明，在沒有化學(xué)和生物誘導(dǎo)成分條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在PHBV納米纖維膜上可以分化為成骨細(xì)胞[3]、成脂細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞[4]。本實驗就是對大鼠BMSCs在PHBV納米纖維膜上分化為神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行研究，以了解PHBV納米纖維材料對細(xì)胞形態(tài)的影響，探討它們作為神經(jīng)組織工程載體材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4周SD雌性大鼠6只(江蘇省實驗動物中心提供)，靜電紡絲制備定向與非定向PHBV納米纖維材料膜(東南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系仿生材料研究室提供),定向PHBV纖維直徑為(383±143)nm，非定向PHBV纖維直徑為(500±86)nm，孔徑為100～150 μm，孔隙率93%(圖1)。主要試劑: a-MEM培養(yǎng)液、DMEM低糖培養(yǎng)液、胎牛血清(hyclone)，維甲酸(RA)，兔抗巢蛋白(Nestin)。實驗儀器: 掃描電子顯微鏡(德國FEI公司)，倒置熒光顯微鏡(尼康)，共聚焦顯微鏡(Andor， Northem Ireland)。

a.定向納米纖維； b.非定向納米纖維

圖1 高壓滅菌后PHBV靜電紡絲纖維膜SEM照片

1.2 方法

1.2.1BMSCs的提取 將4周齡SD大鼠的脛骨和股骨分離出來，浸泡在75%的乙醇中，轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用培養(yǎng)液洗去骨表面的乙醇，沿骨垢剪掉骨的兩端，暴露出骨髓腔，用無菌注射器吸取10 ml細(xì)胞生長培養(yǎng)液(α-MEM，美國，添加10%的胎牛血清及1%的雙抗，美國)沖洗骨髓腔，將骨髓沖出轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。提取后培養(yǎng)24 h首次換液，以后每3 d換液1次。約1周后懸浮細(xì)胞經(jīng)換液大部分被除去，貼壁生長的即為BMSCs。10 d后BMSCs達(dá)到80%融合，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞后0.25%的無EDTA的胰酶37 ℃消化5 min，然后加入3 ml 培養(yǎng)液終止消化。吹打均勻后，細(xì)胞懸液以1∶2 傳代到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

1.2.2PHBV納米纖維的處理 無菌條件下將制備好的PHBV膜從塑封袋中取出，平鋪于48孔板中，其中定向及非定向PHBV膜各占15孔，PHBV材料膜上用特質(zhì)壓環(huán)固定，防止材料上浮，對照組孔板中平鋪玻片，每孔加200 μl培養(yǎng)基。接種前預(yù)浸泡24 h。

1.2.3BMSCs的接種 將BMSCs傳至第3代，按1×104個·ml-1接種至48孔板中，每孔加200 μl細(xì)胞懸液置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞與PHBV納米纖維膜融合后將樣品從培養(yǎng)板中取出，輕輕地用PBS洗3次，用2.5%的戊二醛室溫下固定2 h，PBS洗1次后用梯度酒精脫水(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)各10 min。樣品自然干燥，噴金后用SEM(Ultra plus，Zeiss，德國)觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.4BMSCs的誘導(dǎo)及分化 其余各孔吸除培養(yǎng)基，加入RA誘導(dǎo)液200 μl置于37 ℃培養(yǎng)箱中，72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每隔3 d換1次液，至第6天時取出PHBV膜，多聚甲醛固定，使用電鏡觀察細(xì)胞在PHBV纖維膜上的生長形態(tài)。

1.2.5細(xì)胞免疫組化染色 取出的PHBV材料膜用PBS洗滌3次，每次3 min，4%甲醛PBS固定細(xì)胞, 3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，之后用山羊血清封閉。加入兔抗大鼠神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白Nestin(1∶100)特異性一抗，4 ℃濕盒孵育過夜，滴加試劑1。室溫孵育20 min，PBS洗3次，滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS洗3次，DAB溶液顯色，純水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片(具體方法參照美國GBI公司兔超敏二步法免疫組化試劑盒說明)。在免疫熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)觀察

原代細(xì)胞接種1 d后開始貼壁增殖，2 d后首次換液去除未貼壁細(xì)胞。3～4 d后細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，呈集落樣生長，7 d左右可觀察到貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀見圖2。

2.2 BMSCs在PHBV納米材料上的生長形態(tài)及黏附情況

電鏡下可觀察到細(xì)胞很好地黏附在PHBV納米纖維膜上。在定向PHBV納米纖維膜表面可以看到細(xì)胞沿纖維方向被拉長，還可以觀察到絲狀偽足沿著纖維的方向延伸，在非定向PHBV納米纖維膜上生長的BMSCs向四周伸展，主要呈現(xiàn)出三角形或梭形形貌。而且我們發(fā)現(xiàn)，非定向PHBV納米纖維膜相對于定向PHBV納米纖維膜表現(xiàn)出更好的細(xì)胞相容性(圖3、4)。

圖2 BMSCs在玻片上生長增殖圖

圖3 BMSCs在定向PHBV納米纖維膜上培養(yǎng)的SEM圖

圖4 BMSCs在非定向PHBV納米纖維膜上培養(yǎng)的SEM圖

2.3 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化及免疫熒光染色鑒定

傳至第3代的BMSCs加入含有RA的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)液，72 h后在倒置顯微鏡下即可見少量細(xì)胞胞體開始回縮，邊緣變得不規(guī)整，突起逐漸伸出(圖5)。6 d后取出PHBV納米纖維膜，固定后置于電鏡下觀察，定向PHBV組的神經(jīng)元樣細(xì)胞被顯著拉長，并且細(xì)胞沿定向纖維的方向伸展，非定向PHBV組與對照組的神經(jīng)細(xì)胞則沒有明顯的拉長狀態(tài)，且細(xì)胞的突起多于定向組(圖6)。3組誘導(dǎo)6 d后均行Nestin抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見3組均有Nestin抗體免疫陽性的表達(dá)，即神經(jīng)干細(xì)胞的生成(圖7)。

圖5 BMSCs在玻片上誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化圖

a.神經(jīng)細(xì)胞在定向PHBV納米纖維膜分化生長圖； b.神經(jīng)細(xì)胞在非定向PHBV納米纖維膜分化生長圖

圖6 神經(jīng)細(xì)胞在PHBV納米纖維膜上生長的SEM圖

a.定向PHBV； b.非定向PHBV； c.玻璃片

圖7 RA誘導(dǎo)BMSCs在不同材料上向神經(jīng)方向分化免疫熒光染色圖

3 討 論

研究顯示BMSCs在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后，誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞方向分化并植入到受損的大鼠脊髓處，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)大鼠的功能恢復(fù)，但是并沒有使功能恢復(fù)達(dá)到理想的結(jié)果[5]。結(jié)合文獻(xiàn)我們認(rèn)為，雖然移植BMSCs可促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)，但是其植入的體內(nèi)環(huán)境可能最終影響其分化，導(dǎo)致修復(fù)效果不理想[6-7]。我們設(shè)想為移植的BMSCs營造一個適合的三維環(huán)境，可促使其最大限度地發(fā)揮作用，我們猜想將BMSCs置入某種材料后植入脊髓損傷的區(qū)域，來觀察其對脊髓損傷的修復(fù)。

近年來組織工程技術(shù)發(fā)展日新月異，PHBV因為其良好的降解性和生物相容性被制作成了不同類型的支架用于組織工程領(lǐng)域[8]。在眾多支架材料中，通過靜電紡絲技術(shù)制成纖維的直徑分布可從數(shù)十納米到幾微米，可以很好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)，因此得到了越來越多的關(guān)注[9]。本實驗中，定向及非定向的PHBV納米纖維膜是通過靜電紡絲的技術(shù)獲得，制作過程中加入了PEO，提高了PHBV的可加工性，因此制成了直徑均勻、連續(xù)性很好的納米纖維膜[10]。除了支架，組織工程中另一重要因素便是種子細(xì)胞，通過實驗觀察可見BMSCs在PHBV納米纖維膜表面黏附和增殖明顯優(yōu)于在玻璃片上，這是因為納米纖維膜有著更高的孔隙率、表面粗糙度和比表面積，這些結(jié)構(gòu)特性可以使納米纖維能更好地和細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞之間的通信、營養(yǎng)物質(zhì)的交換以及新陳代謝作用[11]。Wei等[12]指出細(xì)胞在定向和非定向PHBV納米纖維膜上的黏附及活性也有差異，與定向PHBV納米纖維相比，非定向PHBV納米纖維表現(xiàn)出更好的細(xì)胞相容性，更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這可能是由于非定向PHBV納米纖維的表面空隙及粗糙程度比定向PHBV納米纖維更大，更易于細(xì)胞的黏附。將BMSCs接種于不同取向的PHBV納米纖維膜及載玻片上，待細(xì)胞與各組材料融合后，結(jié)合SEM觀察我們發(fā)現(xiàn)，生長于PHBV納米纖維膜表面時，細(xì)胞的絲狀偽足沿納米纖維的方向延展，且細(xì)胞形態(tài)與纖維的取向有關(guān)[4,13]。加入RA誘導(dǎo)劑后，分化生成的細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了顯著變化。在定向PHBV納米纖維膜表面的神經(jīng)干細(xì)胞被顯著拉長，并且突起沿定向纖維的方向伸展，非定向PHBV組神經(jīng)干細(xì)胞則無明顯的拉長狀態(tài)，突起則沿著纖維向四周伸展。細(xì)胞生長于定向PHBV納米纖維膜表面時，其長徑比也有顯著增加，Yang等[14]在納米溝槽基底和定向纖維上培養(yǎng)細(xì)胞的研究也得到了相同的結(jié)論，可能由于基底材料的接觸引導(dǎo)作用所致。因此，有特定排列的定向PHBV納米纖維膜更能控制BMSCs分化的神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)，使細(xì)胞沿著一定的方向生長，這與神經(jīng)再生定向生長的性質(zhì)符合。本研究結(jié)果表明定向PHBV納米纖維膜能引導(dǎo)細(xì)胞沿著一定方向生長，我們還需進(jìn)一步利用RT-PCR檢測定向及非定向PHBV納米纖維膜對BMSCs分化率影響的差異，為PHBV材料和BMSCs聯(lián)合移植治療脊髓損傷提供體外依據(jù)。

[1] LI H,ZHAI W,CHANG J,et al.Effects of wollastonite on proliferation and differentiation of human bone marrow-derived stromal cells in PHBV/wollastonite composite scaffolds[J].J Biomater Appl,2009,24(3):231-246．

[2] BLAU O.Bone marrow stromal cells in the pathogenesis of acute myeloid leukemia[J].Front Biosci (Landmark Ed),2014,19:171-180．

[3] 虞海流,茅祖斌,蔣贊利，等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化移植治療大鼠脊髓損傷的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2009,37(2):110-112．

[4] LV L X，ZHANG X F，WANG Y Y,et al.Effects of hydroxyapatite-containing composite nanofibers on osteogenesis of mesenchymal stem cellsinvitroand bone regenerationinvivo[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(2):319-330．

[5] RITFELD G J，NANDOE R D,VAJN K,et al.Bone marrow stromal cell-mediated tissue sparing enhances functional repair after spinal cord contusion in adult rats[J].Cell Transplant,2012,21(7):1561-1575．

[6] NOVIKOV L N，MOSAHEBI A,WIBERG M,et al.A novel biodegradable implant for neuronal rescue and regeneration after spinal cord injury[J].Biomaterials,2002,23(16):3369-3376．

[7] POURHEYDAR B，JOGHATAEI M T，BAKHTIARI M,et al.Co-transplantation of bone marrow stromal cells with schwann cells evokes mechanical allodynia in the contusion model of spinal cord injury in rats[J].Cell J,2012,13(4):213-222．

[8] LIU J，ZHAO B，ZHANG Y,et al.PHBV and predifferentiated human adipose-derived stem cells for cartilage tissue engineering[J].J Biomed Mater Res A,2010,94(2):603-610.

[9] BUTTAFOCE L，KOLKMAN N G，ENGBERS P，et al.Electrospinning of collagen and elastin for tissue engineering applications[J].Biomaterials,2006,27(5):724-734．

[10] BIANCO A,CALDERONE M,CACCIOTTI I.Electrospun PHBV/PEO co-solution blends:microstructure,thermal and mechanical properties[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2013,33(3):1067-1077．

[11] KE Y，WANG Y J，REN L,et al.Modified PHBV scaffolds by in situ UV polymerization:structural characteristic,mechanical properties and bone mesenchymal stem cell compatibility[J].Acta Biomater,2010,6(4):1329-1336．

[12] WEI X，HU Y J，XIE W P,et al.Influence of poly(3-ydroxybutyrate—co-4-hydroxybutyrate-eo-3-hydroxyhexanoate)on growth and osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].J Biomed Mater Res A，2009，90A：894-905.

[13] ZHENG L，YANG J，F(xiàn)AN H,et al.Material-induced chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells is material-dependent[J].Exp Ther Med,2014,7(5):1147-1150．

[14] YANG J Y，TING Y C，LIU H L,et al.Quantitative analysis of osteoblast-like cells (MG63) morphology on nanogrooved substrata with various groove and ridge dimensions[J].J Biomed Mater Res A,2009,90(3):629-640．

Morphological study on inducement and differentiation of nerve cells derived from rat BMSCs on PHBV

SHEN Xu1，JIANG Zan-li1，WU Xiao-tao1，ZHANG Xiao-feng1，XIE Xin-hui1，Xiao Qian-ru2，HUANG Ning-ping2，WANG Ye1

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.StateKeyLaboratoryofBioelectronics，SchoolofBiologicalScienceandMedicalEngineering，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To investigate the impact of PHBV nanomaterials on differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs)into neural stem cells，and to provide a new basis for the treatment of spinal cord injury with combined transplantation containing BMSCs and PHBV. Methods： BMSCs derived from rat bone marrow were used to investigate the effects of aligned(A-NF)and random—oriented(NF) PHBV nanomaterials on cell adhesion and differentiationinvitro， SEM was used to observe BMSCs. Results： After six days of adding in the RA medium，we can see cells extend along with the direction of orientation of the fibers. Neural stem cells were detected with immunostaining for Nestin.Conclusion： The A-NF PHBV has a significant effect on cell morphology by guiding the cytoskeleton extending，neural stem cells are significantly elongated on the surface of the A-NF PHBV compared with the NF PHBV.

bone marrow stromal cells; PHBV nanomaterials; neural stem cells; rats

2015-01-06

2015-03-18

沈旭(1988-)，男，安徽蚌埠人，在讀碩士研究生。E-mail：shenxu233@126.com

蔣贊利 E-mail:jiangzanli@126.com

沈旭,蔣贊利,吳小濤,等.PHBV納米纖維對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)影響[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):531-535.

R681.5; R329.2

A

1671-6264(2015)04-0531-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04.008