吳丹，王彩蓮，李春妍，鄭士亞

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 江陰 214400； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210011； 3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

·論 著·

胰腺癌Kras基因突變與Glut1高表達(dá)協(xié)同促進(jìn)腫瘤發(fā)生

吳丹1，王彩蓮2，李春妍3，鄭士亞2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 江陰 214400； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210011； 3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

目的：探討胰腺癌組織中Kras基因點(diǎn)突變的表達(dá)以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glut1)表達(dá)在促進(jìn)癌細(xì)胞惡性增生中的意義及作用，研究?jī)烧咧g的相關(guān)性。方法：收集46例胰腺癌患者組織蠟塊，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)Glut1在胰腺癌中的表達(dá)，熒光定量PCR測(cè)序法檢測(cè)胰腺癌標(biāo)本中Kras基因點(diǎn)突變率。結(jié)果：46例胰腺癌中Glut1的陽(yáng)性表達(dá)為40例(86.9%)，正常癌旁組織中Glut1不表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Glut1的表達(dá)與年齡、腫瘤大小、腫瘤部位相關(guān)(P<0.05)，與性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、病理分級(jí)、臨床分期、病理類型無(wú)關(guān)。在46例胰腺癌患者中有26例存在Kras基因點(diǎn)突變(56.5%)，其中24例12密碼子突變(G34D 3例，G35D 21例)；2例13密碼子突變(G38D 1例，C39D 1例)。Kras基因點(diǎn)突變與腫瘤大小、神經(jīng)侵犯相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位、臨床分期、病理類型、病理分級(jí)無(wú)關(guān)。胰腺癌中Glut1蛋白呈高表達(dá)時(shí)，Kras基因存在明顯突變，有明顯相關(guān)性(r=0.99，P<0.05)。結(jié)論：Glut1高表達(dá)與Kras基因異常表達(dá)可能協(xié)同促進(jìn)了胰腺癌的惡性病變。

胰腺癌； Kras基因； 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1； 糖酵解

胰腺癌是惡性程度極高的癌癥之一，早期診斷困難，療效差，總體死亡率高達(dá)98%[1]，中位生存期為診斷后4～6個(gè)月，5年生存率僅為5%[2]。掌握胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制并針對(duì)特定通路進(jìn)行治療的手段，為胰腺癌的早期診斷以及治療提供有益的線索尤為重要。

我們通過(guò)運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色及PCR方法分別檢測(cè)46例胰腺癌組織標(biāo)本中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glut1)的表達(dá)和Kras(Kirsten rat sarcoma viraloncogene homolog)基因突變，分析兩者之間的相關(guān)性，在分子水平上初步探討胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為胰腺癌的早期診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

來(lái)自江陰市人民醫(yī)院2005年1月至2014年12月間經(jīng)外科手術(shù)切除的胰腺癌組織石蠟標(biāo)本，共46例。所有病例資料完整，均經(jīng)病理組織學(xué)確診，按照胰腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[3]。其中男25例，女21例；年齡37～84歲，中位年齡66歲；高分化腺癌(Ⅰ級(jí))10例，中分化腺癌(Ⅱ級(jí))21例，低分化腺癌(Ⅲ級(jí))15例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例。病理分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期21例。同時(shí)切取癌旁的胰腺組織標(biāo)本作為正常胰腺組織對(duì)照。

1.2 主要試劑

兔抗人Glut1多克隆抗體(南京巴傲得生物科技有限公司)，免疫組化EliVision plus試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，人類Kras基因突變檢測(cè)試劑盒(蘇州科貝生物技術(shù)有限公司)。

1.3 胰腺癌組織及正常組織中Glut1免疫組化檢測(cè)

(1) 采用免疫組化S-P法，參照EliVision plus試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體如下：取胰腺癌組織，連續(xù)石蠟切片，60 ℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟，然后水化，0.5%過(guò)碘酸處理后，予PBS沖洗；接著浸入檸檬酸緩沖液修復(fù)液加熱，再用PBS沖洗；滴加3%雙氧水，再次PBS沖洗；最后滴加正常山羊血清封閉液；滴加Glut1多克隆抗體一抗50 μl(稀釋度1∶250)，放入4℃冰箱過(guò)夜；第2天復(fù)溫，PBS沖洗，并依次滴加生物素標(biāo)化二抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素溶液，PBS沖洗；最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹(shù)脂封片，鏡下查看切片。每組切片均以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，其他步驟同前。

(2) 免疫組化結(jié)果判斷：Glut1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。按腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性比率評(píng)分：0分，沒(méi)有細(xì)胞著色；1分，腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率≤5%；2分，腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率6%～14%；3分，腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率15%～30%；4分，腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率>30%。按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)弱評(píng)分：0分，沒(méi)有細(xì)胞著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分+腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)弱評(píng)分作為最終評(píng)分。根據(jù)最終評(píng)分，將Glut1染色分為4個(gè)等級(jí)：0-1分為陰性(0)，2-3分為弱陽(yáng)性(1+)，4-6分為陽(yáng)性(2+)，>6分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。片內(nèi)正常胰腺組織及間質(zhì)細(xì)胞無(wú)著色，作為陰性對(duì)照。

1.4 PCR檢測(cè)胰腺癌組織中Kras突變基因的表達(dá)

(1) 基因組DNA抽提：采用Qiagen公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)提取組織DNA，常規(guī)切片厚4 μm 5～10張，經(jīng)脫蠟、蛋白酶K消化及離心，將DNA洗脫。將DNA稀釋，稀釋至質(zhì)量濃度為100 ng·μl-1，體積為50 μl。1張用于HE染色觀察形態(tài)，其余用于下一步提取DNA；顯微鏡下觀察HE切片，選取富于腫瘤細(xì)胞的區(qū)域，對(duì)應(yīng)HE切片將腫瘤組織刮入裂解液，保證腫瘤成分80%以上。

(2) PCR法擴(kuò)增Kras基因第2號(hào)外顯子：根據(jù)Kras基因組DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，Kras基因第2號(hào)外顯子上游引物為KRAS F1(GCCTGCTGAAAATGACTGAA)和KRAS F2(AAGGCCTGCTGAAAATGACTG)，下游引物為KRAS R1 (GTATCGTCAAGGCACTCTTGC)和KRAS R2 (AGAATGGTCCTGCACCAGTAA)。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件如下： 95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共45個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min，至40 ℃結(jié)束。以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性病例作為陽(yáng)性對(duì)照。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色。

(3) DNA測(cè)序：將DNA PCR產(chǎn)物(20 μl)磁珠純化，配制測(cè)序反應(yīng)體系，總反應(yīng)體積5 μl，蓋緊PCR 管，用手指彈管混勻，稍離心后，將PCR 管置于PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物醋酸鈉純化后，上ABl3730 DNA Analyzer進(jìn)行PAGE電泳。采用Sequence Analysis 軟件進(jìn)行序列分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Glut1表達(dá)、Kras突變與各臨床指標(biāo)的關(guān)系之間比較采用卡方檢驗(yàn)，Glut1表達(dá)與Kras突變的相關(guān)性用Spearman法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Glut1在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達(dá)結(jié)果

46例胰腺癌組織中，Glut1棕黃色或棕褐色陽(yáng)性染色顆粒位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，主要定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性表達(dá)率為86.9%(40/46)，正常胰腺組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(表1、圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 Glut1 在胰腺組織中的表達(dá)

2.2 Kras在胰腺癌中的突變情況

46例胰腺癌患者中有26例患者存在Kras基因突變(56.5%)，其中24例12密碼子突變(G34D 3例，G35D 21例),2例13密碼子突變(G38D 1例，C39D 1例)。

2.3 胰腺癌中Glut1蛋白表達(dá)及Kras基因突變與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌組織中Glut1表達(dá)與年齡、腫瘤大小、腫瘤部位具有顯著相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kras的突變與腫瘤大小和神經(jīng)侵犯相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 胰腺癌中Glut1蛋白表達(dá)與Kras基因突變的相關(guān)性

在Glut1陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)本中，隨著Glut1染色評(píng)分的遞增，KRAS基因的突變率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.99，P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討 論

Kras基因是Ras原癌基因家族的一員，其表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)及分化密切相關(guān)[4]。以往研究證實(shí)，超過(guò)90%的胰腺癌都存在Kras基因的點(diǎn)突變[5]。在胰腺癌中，單氨基酸置換G12、G13或Q61導(dǎo)致K-ras GTP水解活性失活，而且降低了對(duì)GAP的敏感性，從而導(dǎo)致磷酸化的K-ras持續(xù)聚積，與下游效應(yīng)分子結(jié)合，導(dǎo)致了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[6]。Glut1是分布最廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種膜性易化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的功能是運(yùn)輸葡萄糖進(jìn)入上皮細(xì)胞及促進(jìn)細(xì)胞的代謝[7]，它的表達(dá)強(qiáng)弱與腫瘤惡性程度有關(guān)[8]。

A.正常胰腺組織中Glut1表達(dá)為陰性，標(biāo)記為(-)(×100)； B.胰腺癌組織中Glut1陰性表達(dá)，標(biāo)記為(-)(×200)； C.胰腺癌組織中的Glut1的弱陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)記為(1+)，(×200)； D.胰腺癌組織中的Glut1的中度陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)記為(2+)(×200)； E.胰腺癌組織中Glut1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)記為(3+)(×200)

圖1 免疫組化檢測(cè)Glut1在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達(dá)

表2 Glut1表達(dá)及Kras突變與患者臨床病理特征的關(guān)系

表3 Glut1表達(dá)與Kras突變之間的相關(guān)性

Spearman’s rank test法：r=0.99，P=0.033

在低糖環(huán)境下Kras野生型細(xì)胞很難存活，而存活下來(lái)的Kras突變型細(xì)胞中Glut1高表達(dá)，且其中4%發(fā)生親代未出現(xiàn)過(guò)的Kras突變[9]。進(jìn)一步研究表明，Kras基因突變與Glut1表達(dá)在肺癌組織中也存在一定的的相關(guān)性[10]。兩者關(guān)系在胰腺癌組織中是否相關(guān)，目前還沒(méi)有相應(yīng)的臨床研究。鑒于此，我們以胰腺癌組織為標(biāo)本，檢測(cè)了46例癌組織切片中Glut1的表達(dá)及Kras的突變，結(jié)果顯示胰腺癌中Kras基因突變率為56.5%，主要是12位點(diǎn)突變。而Glut1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為86.9%，對(duì)應(yīng)癌旁組織基本無(wú)表達(dá)，且其與Kras突變率呈正相關(guān)，提示KRAS基因突變可上調(diào)Glut1的表達(dá)。

在胰腺癌治療中以Kras突變的靶向治療方案并沒(méi)有取得令人驚喜的研究進(jìn)展[11-12]。因此，我們便進(jìn)一步探討針對(duì)細(xì)胞Kras基因的下游靶點(diǎn)的療法研究。PET/CT是胰腺癌的可靠而有效的診斷方法[13]，而利用氟代脫氧葡萄糖(FDG)可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞葡萄糖吸收。目前，抗腫瘤細(xì)胞能量代謝正成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞即使在供氧充足的情況下，葡萄糖依舊向乳酸轉(zhuǎn)換，這種代謝稱為有氧酵解或“Warburg效應(yīng)”。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導(dǎo)卵巢癌和肺癌細(xì)胞FDG攝入量增加，并可通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)HIF-Ia上調(diào)Glut1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖代謝。

很多夫妻之所以會(huì)走到離婚的那一步，往往是因?yàn)槠綍r(shí)沒(méi)有及時(shí)處理婚姻中出現(xiàn)的各類問(wèn)題或矛盾。當(dāng)婚姻中出現(xiàn)問(wèn)題的時(shí)候，夫妻之間需要及時(shí)溝通。出現(xiàn)問(wèn)題并不可怕，可怕的是當(dāng)問(wèn)題出現(xiàn)后，彼此熟視無(wú)睹，互不相讓，導(dǎo)致婚姻中的問(wèn)題越堆越多。夫妻間應(yīng)坦誠(chéng)相處，做到相互關(guān)照，這樣比贈(zèng)送禮物更令人高興。

癌基因Ras的突變或者過(guò)表達(dá)常見(jiàn)于惡性腫瘤，通過(guò)介導(dǎo)HIF表達(dá)，來(lái)促進(jìn)糖酵解。在應(yīng)用誘導(dǎo)Kras G12位點(diǎn)突變建立的胰腺癌小鼠模型中，Kras G12位點(diǎn)突變?cè)诳刂颇[瘤代謝中作用很大，主要通過(guò)刺激葡萄糖攝取，驅(qū)動(dòng)糖酵解，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。已有研究結(jié)果[15]證實(shí)，針對(duì)糖酵解過(guò)程的腫瘤治療手段是可行的。Kras突變與Glut1存在一定的相關(guān)性[16-17]。因此，我們猜想胰腺癌細(xì)胞Glut1的高表達(dá)可能與腫瘤在低氧環(huán)境下Kras基因的突變介導(dǎo)HIF的高表達(dá)有關(guān)，但是仍需要大量后續(xù)研究去證實(shí)。靶向Glut1及糖酵解治療胰腺癌也不失可作為Kras分子靶向治療的新手段，且具有良好的應(yīng)用前景。

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Synergy of tumorigenesis between high-Glut1 expression and Kras mutation in pancreatic cancer

WU Dan1，WANG Cai-lian2,LI Chun-yan3，ZHENG Shi-ya2

(1.DepartmentofOncology，theAffiliatedJiangyinHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege，Jiangyin214400，China; 2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 3.NanjinMedicalUniversity，Nanjing210029，China)

Objective: To analyze the relationship between overexpression of Glut1 and Kras mutations in pancreatic cancer.Methods:In 46 cases of pancreatic carcinoma and 46 cases of tumor adjacent normal pancreatic tissues，immunohistochemistry was performed for Glut1 expression status. Kras mutation status was also evaluated using PCR-based assays.Results:Glut1 expression was increased in 40(86.9%) pancreatic cancer cases. At the same time ，it was not expressed in adjacent controls (P<0.001).The Glut1 overexpression was significantly associated with age(<56，62.5%vs>56，92.1%，P<0.05)，tumor size(<6 cm，92.1%vs>6 cm，62.5%，P<0.05)，tumor location(head，100%vsnon-head，71.4%，P<0.01)，Kras mutation was found in 26 (56.5%) pancreatic cancer cases. The Kras mutation was associated with tumor size(<6 cm, 63.2%vs>6 cm, 25%，P<0.05)，nerve invasion (absent，51.3%vspresent，88.9%，P<0.05). The Glut1 overexpression status was significantly correlated with Kras mutation status (r=0.99，P<0.05).Conclusion:Our results strongly suggest that overexpression of Glut1 is significantly correlated with Kras mutations in pancreatic cancer to increase the tumor genesis．

pancreatic cancer; glucose transporter isoform 1; Kras; glycolysis

2015-09-22

2015-10-14

吳丹(1978-)，女，江蘇江陰人，主治醫(yī)師。E-mail:wudan96121@163.com

吳丹，王彩蓮，李春妍，等.胰腺癌Kras基因突變與Glut1高表達(dá)協(xié)同促進(jìn)腫瘤發(fā)生[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：982-986.

R735.9

A

1671-6264(2015)06-0982-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．028