馮曉云，葛琴，陸志斌

(1.南通市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南通 226361； 2.南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院 胸外科，江蘇 南京 211800)

·論 著·

非小細胞肺癌患者血清miR-133b的表達水平及其臨床意義探討

馮曉云1，葛琴1，陸志斌2

(1.南通市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南通 226361； 2.南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院 胸外科，江蘇 南京 211800)

目的：探討非小細胞肺癌患者血清miR-133b的表達水平與臨床病理特征及疾病預后的關系。方法：將80例經(jīng)病理活檢證實為非小細胞肺癌患者納入此次研究的對象，同期選取進行體檢的健康人群80例作為正常對照組，采用real-time熒光定量PCR方法檢測所有人員血清miR-133b的表達水平，進一步分析非小細胞肺癌患者血清miR-133b的表達水平與患者的臨床及病理特征的關系。結果：非小細胞肺癌患者血清miR-133b表達水平(0.86±1.27)顯著低于正常對照組的表達水平(1.78±1.36)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.572，P=0.004)。非小細胞肺癌患者血清miR-133b的表達水平與病理分期、腫瘤分化程度、抽煙史及是否發(fā)生淋巴結轉移等因素密切相關(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑及病理分型無關(P>0.05)；非小細胞肺癌患者術后miR-133b高表達者1年內(nèi)的生存率(73.8%)明顯高于miR-133b低表達者(52.6%)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.580，P=0.003)。結論：血清miR-133b的檢測有助于早期對非小細胞肺癌進行篩選與診斷，其表達與非小細胞肺癌臨床及病理特征、治療后存活時間具有明顯的相關性，對評估非小細胞肺癌的預后具有一定價值。

非小細胞肺癌； miR-133b； 表達； 生存率

隨著miRNA在腫瘤領域研究的不斷深入，許多microRNAs被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在表達異?，F(xiàn)象，其中miR-133b最為關注。miR-133b定位于6號染色體(6P12.2)，起初被認為是一種與肌肉特異性相關的miRNA，其主要參與骨骼肌的生長與發(fā)育[1-2]。近年來有學者對淋巴結轉移陽性和轉移陰性的非小細胞肺癌(NSCLC)組織miRNA微陣列分析表明，NSCLC組織多種miRNA表達異常，其中miR-133b在淋巴結轉移陽性NSCLC癌組織中的表達缺失或下調(diào)顯著高于淋巴轉移陰性NSCLC癌組織[3]。在多種腫瘤中miR-133b的過度表達可抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，miR-133b具有調(diào)控miRNA靶基因的作用，即轉錄后負調(diào)控作用，miR-133b可能是一個腫瘤抑制基因[4-5]。本研究通過檢測血清miR-133b在NSCLC患者中表達變化，探討其與臨床病理特征及疾病預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

NSCLC組：經(jīng)活檢病理證實為NSCLC患者80例，均未行放化療及手術治療。按照WHO標準(2004版)[6]進行組織學分類及UICC (2009年第7版)標準進行TNM分期。Ⅰ～Ⅲ期患者35例行手術治療，Ⅳ期患者45例行放、化療治療。正常對照組：同期進行體檢的正常人80例。整理NSCLC觀察組和正常對照組的一般資料(如年齡、性別、既往病史、家族遺傳病史等)。記錄NSCLC觀察組患者的治療方式、吸煙與否、淋巴結是否轉移、是否遠處轉移、病理類型、TNM分期及分化程度等臨床資料，并對所有患者進行為期1年的隨訪。

1.2 標本采集

收集NSCLC組患者與正常對照組的血清標本。于清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血5 ml,靜置20 min，室溫3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。將血清轉移至收集管，按照400～500 μl·管-1分裝好，放入-80℃恒溫冰箱保存。

1.3 主要儀器與試劑

可見紫外自動掃描分光光度計(美國Stratagene公司)，7500 Real Time PCR System(美國ABI公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，血清RNA試劑盒、mirVana Protein And RNA Isolation System(Life Technologies公司)，RT試劑盒、TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix (美國ABI公司)，Golden view核酸染料(中生瑞泰科技)，EB(美國AMRESCO公司)，Elution Solution(上海葉舟生物科技有限公司)，DEPC(北京中生瑞泰科技公司)，Agarose瓊脂糖(美國Invitrogen公司)。

1.4 血清中總RNA的提取

取400 μl血清于離心管中，加入溶解試劑，充分混勻裂解；之后按RNA提取試劑盒說明書來分離提取總RNA。測定RNA濃度及純度，所抽RNA純度較好，可用于cDNA的合成。

1.5 逆轉錄合成

采用cDNA及real-time PCR將提取的RNA利用TaqMan miRNA 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。U6作為內(nèi)標。反應體系：RNA模板2 μl、RT引物2 μl及ddH2O 7 μl?；靹蛞陨象w系，瞬時離心。70℃放置10 min，冰育2 min，再加入RT buffer 5×5 μl、dNTP mix(2.5 mm)2 μl、RNase inhibitor(40 U·μl-1) 0.5 μl、RT酶(200 U·μl-1)0.5 μl及ddH2O 17 μl?；靹蛞陨象w系，42℃ 60 min，70℃10 min。合成的cDNA放-80℃?zhèn)溆?。熒光定量PCR 檢測反應體系：TaqMan Gene Expression Master Mix 10 μl、RT產(chǎn)物5 μl、正向Bulge-LoopTM miRNA Primer(5 μmol·L-1) 1 μl、反向Bulge-LoopTM miRNA Primer(5 μmol·L-1)1 μl、RNase-free H2O 3 μl。正向引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGA

CT-3′，反向引物5′-CACTATAGGTTTTTTTTTTTTCG-3′。熒光定量 PCR循環(huán)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃ 1 min(共40個循環(huán))。miRNA的相對表達量用RQ=2-△△CT來表示，△△CT=實驗組(CTmiRNA-CTU6)-對照組(CTmiRNA-CTU6)均值。

1.6 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以率表示。對miR-133b在NSCLC患者及正常受試者血清中的表達結果行t檢驗。對miR-133b低表達及高表達組間miRNA表達差異及各臨床病理特征(年齡、性別、吸煙與否、淋巴結是否轉移、是否遠處轉移、病理類型、TNM分期等)與表達量的關系均采用χ2檢驗；治療后NSCLC患者根據(jù)miR-133b的表達水平分為兩組(高于miR-133b表達的均值0.86為高表達，低于其均值為低表達)，不同miR-133b表達水平組別的1年內(nèi)生存率比較采用χ2檢驗。以上所有統(tǒng)計學分析均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-133b在NSCLC患者及正常受試者血清中的表達

熒光定量PCR分析表明，NSCLC患者血清miR-133b相對表達量(RQ)均值為0.86±1.27，低于正常受試者的1.78±1.36，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.572，P=0.004),見圖1。

圖1 80例NSCLC患者與80例正常受試者血清miR-133b的表達

Fig 1 80 patients with NSCLC and 80 normal subjects serum miR-133b expression

2.2 miR-133b與NSCLC患者臨床及病理特征的關系

血清miR-133b的表達水平與NSCLC患者的病理分期(TNM分期)、腫瘤分化程度、抽煙史及是否發(fā)生淋巴結轉移等因素密切相關，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；但與患者的性別、年齡、腫瘤直徑及病理分型無關(P>0.05)，見表1。

表1 miR-133b與NSCLC患者各臨床及病理特征的關系 例

Tab 1 The relationship of miRNA-133b with clinical pathological features of NSCLC patients cases

注：miR-133b值大于0.86為高表達，低于0.86為低表達;括號內(nèi)為相應百分數(shù)

2.3 miR-133b的表達與患者術后存活時間的關系及NSCLC的預后價值

NSCLC患者術后中miR-133b高表達者1年內(nèi)的生存率為73.8%(31/42)，miR-133b低表達者1年內(nèi)的生存率為52.6%(20/38)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.580，P=0.003)。

3 討 論

miR-133b最初被認為是一種心肌特異性的miRNA，可靶向調(diào)節(jié)一些關鍵性的心肌發(fā)育及肌信號通路相關基因[7-8]。近年來，國外研究[9-10]發(fā)現(xiàn)miR-133b通過降低肺癌細胞MCL-1與BCL2L2的表達，達到誘導癌細胞凋亡的作用，這樣的結果為臨床用檢測miR-133b來判斷肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后提供了實驗基礎。

本研究采用實時熒光定量PCR檢測非小細胞性肺癌患者血清中miR-133b的表達變化，通過與正常受試者血清miR-133b的表達水平比較，NSCLC患者血清中的miR-133b表達水平顯著低于正常受試者血清miR-133b的表達水平，提示miR-133b水平的降低預示有癌變的可能。同時發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清miR-133b的表達水平與NSCLC患者的病理分期(TNM分期)、腫瘤分化程度、抽煙史及是否發(fā)生淋巴結轉移等因素密切相關，而與NSCLC患者的性別、年齡、腫瘤直徑及病理分型無關；提示血清miR-133b水平的變化可能與NSCLC患者腫瘤分化程度以及是否發(fā)生侵襲性轉移有關。根據(jù)miR-133b表達水平對NSCLC患者進行分組后隨訪1年發(fā)現(xiàn)，miR-133b高表達者1年內(nèi)的存活率明顯高于低表達者，提示NSCLC患者術后其血清miR-133b高表達者存活時間較長，預后較好。

miR-133b在不同腫瘤中可能因主要作用靶點不同，而在不同的病理過程中發(fā)揮不同的作用[11-12]。對miR-133b生物學效應的研究顯示，其可以通過靶向EGFR而抑制EGFR下游信號通路來發(fā)揮抑制NSCLC增殖和侵襲轉移能力的作用，這種作用在EGFR依賴的肺癌細胞中特別明顯[13]。同時miR-133b能夠改善NSCLC細胞對于EGFR-TKI的敏感性，從而推測miR-133b的表達水平高低可能與NSCLC的生物學行為具有相關性[14]。

綜上所述，血清miR-133b在正常人和NSCLC患者之間存在表達差異，可能有助于對NSCLC的早期篩選與診斷。血清miR-133b的表達與NSCLC各臨床及病理特征、治療后存活時間具有相關性，對NSCLC的預后評估具有一定價值。

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Serum miR-133b levels and its relation with clinical pathological characteristics in non-small cell lung cancer patients

FENG Xiao-yun1，GE Qin1，LU Zhi-bin2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，NantongTumorHospital，Nantong226361，China; 2.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery，PukouCentralHospital，Nanjing211800，China)

Objective: To explore the relationship between serum miR-133b levels and clinical pathological characteristics，as well as prognosis of disease in non-small cell lung cancer patients.Methods:A total of 80 patients were diagnosed as non-small cell lung cancers by pathological biopsy were included in this study. Meanwhile，80 health people underwent health examinations were selected as controls. The levels of serum miR-133b were measured by real-time PCR.Results:The serum miR-133b level in non-small cell lung cancer patients was (0.86±1.27)，which was obviously lower than that of the normal controls (1.78±1.36) (t=9.572，P=0.004)，and the differences had significance (P< 0.05). The serum miR-133b levels were related to the pathologic stage，tumor differentiation grade，smoking history and lymph node metastasis (P<0.05). The patients with high expression of serum miR-133b levels had greater 1-year survival rates than those of the low expression of serum miR-133b patients (52.6%) (χ2=8.580，P=0.003).Conclusion:Detection of serum miR-133b levels is beneficial for early screening and diagnosing non-small cell lung cancers. Closely related to the clinical pathological characteristics，survival times after treatment，it is a valuable tool for evaluating the prognosis of non-small cell lung cancer patients．

non-small cell lung cancer; miR-133b; expression; survival rate

2015-06-15

2015-08-25

南京市科技局項目(201303034)

馮曉云(1983-)，女，江蘇南通人，主管技師，醫(yī)學碩士。E-mail:ntfengxiaoyun@126.com

陸志斌 E-mail:luzhibin1983@126.com

馮曉云，葛琴，陸志斌.非小細胞肺癌患者血清miR-133b的表達水平及其臨床意義探討[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2015，34(6)：934-937.

R734.2

A

1671-6264(2015)06-0934-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．017