尋慶英，王玲玲，周懷君

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009; 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008)

·論 著·

siRNA抑制RRM2表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖影響的研究

尋慶英1，王玲玲2，周懷君2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009; 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008)

目的：探討小干擾RNA(siRNA)抑制RRM2基因表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。方法：針對(duì)RRM2基因設(shè)計(jì)siRNA，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將siRNA片段導(dǎo)入Ishikawa細(xì)胞中。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率、凋亡率及細(xì)胞周期，用MTT比色法檢測(cè)siRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響，半定量q-PCR和Western blot分別檢測(cè)RRM2在mRNA和蛋白水平上表達(dá)的變化，用transwell小室檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力。結(jié)果：設(shè)計(jì)的siRNA能有效地抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖，降低侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞阻滯于G1期，減少S和G2期的細(xì)胞，同時(shí)RRM2在mRNA及蛋白水平上的表達(dá)明顯減少，而對(duì)照的錯(cuò)義序列組Ishikawa/Neg-ative-siRNA則沒(méi)有上述效應(yīng)。結(jié)論:體外合成的siRNA可降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中RRM2的表達(dá)，且抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯。

小干擾RNA； RRM2基因； 子宮內(nèi)膜癌； Ishikawa細(xì)胞

核糖核苷酸還原酶M2(ribonucleotide reductase small subunit，RRM2)是DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵限速酶[1]，眾多研究表明RRM2與癌腫生物學(xué)行為有直接相關(guān)性。Cui等[2]檢測(cè)到了RRM2 在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD) 中的表達(dá)部位和表達(dá)水平，并從基因的mRMA和蛋白水平證明其存在著高表達(dá)。目前，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是一項(xiàng)特異性抑制基因表達(dá)的成熟方法。一些短的雙鏈RNA即小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，可以高效、特異地降解相關(guān)基因的mRNA，誘導(dǎo)細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型[3]。如果將這一技術(shù)應(yīng)用于臨床致病基因的治療，將有助于克服化療藥物的耐藥性以及對(duì)某些惡性腫瘤不敏感等問(wèn)題[4]。本實(shí)驗(yàn)以RRM2基因?yàn)榘心繕?biāo)，設(shè)計(jì)合成了ds-siRNA，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa，獲得RRM2表達(dá)抑制細(xì)胞模型，并對(duì)該細(xì)胞的增殖、侵襲能力、凋亡、生長(zhǎng)能力進(jìn)行體外的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa由北京大學(xué)魏麗惠教授惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(杭州四季青公司)；MEM培養(yǎng)基、Trizol 試劑、Lipofectamine 2000TM 脂質(zhì)體( Invitrogen 公司)；MTT(Sigma 公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz 公司); BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(凱基公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq聚合酶(美國(guó)Promega公司)；RRM2一抗、GAPDH一抗(abCAM公司); RRM2二抗、GAPDH二抗(CHEMICON公司)。凋亡試劑盒、周期試劑盒及Matrigel(BD公司)；Transwell小室(Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa用含10%滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2siRNA設(shè)計(jì)合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]和siRNA 的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)干擾序列siRNA為5′-GGATCCCTG TTCTATCCGAACAGCATTTTGATATCCGAATGCTGTTC GGATAGAACAGCGCTCGAG-3′，同時(shí)設(shè)計(jì)出非特異性靶序列為5′-GGATCCCCACGGCCTGCTTAATTAATG TTGATATCCGACATTAATTAAGCAGGCGTGGCGCTCG AG-3′，由Genscript公司合成、測(cè)序，測(cè)序正確后大量提取質(zhì)粒，-20 ℃保存。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在6孔培養(yǎng)板中常規(guī)接種Ishikawa細(xì)胞，待細(xì)胞70%～80%融合后，根據(jù)Lipofectamine2000TM試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。siRNA與Lipofectamine2000TM分別用適量不含血清和抗生素的MEM稀釋，5 min內(nèi)按最佳轉(zhuǎn)染比例混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞孔中，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察。將轉(zhuǎn)染了RRM2-siRNA的細(xì)胞命名為Ishikawa/RRM2-siRNA，轉(zhuǎn)染了Negative-RRM2的細(xì)胞命名為Ishikawa/Negative-siRNA。轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及凋亡率 收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h的Ishikawa細(xì)胞，PBS洗滌并重懸細(xì)胞至約106ml-1，每組均分2份。一份直接在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；另一份按凋亡試劑盒說(shuō)明操作后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集不同濃度作用24 h的Ishikawa細(xì)胞及對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌并重懸細(xì)胞至約106ml-1，按周期試劑盒說(shuō)明操作后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，以每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，次日按Lipofectamine 2000TM試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，共3組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，到時(shí)間點(diǎn)后每孔加入20 μl( 5 mg·ml-1)MTT，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入DMSO 150 μl，避光30 min后，充分振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，選擇570 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-轉(zhuǎn)染組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.2.7q-PCR檢測(cè)RRM2 mRNA表達(dá)的變化 收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h及未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞，按Trizol操作說(shuō)明，分別提取總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系25 μl:2 μg RNA，1 μl Oligo(dT)，1 μl M-MlvRT酶，2 μl dNTP(10 mmol·L-1)，5 μl 5×buffer，DEPC水補(bǔ)至25 μl，按說(shuō)明書(shū)步驟操作。PCR 反應(yīng)以β-actin 為內(nèi)參照，RRM2上游引物序列為5′-AGAGGCTACCTA TGGTGA ACG-3′，下游引物的序列為5′-GTCTGTCTGCCACAAACTCAA-3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度359 bp；β-actin上游引物為5′-GCTCGTCGTCGACAACGG CTC-3′，下游引物為5′ -CAAACATGATCTGGGTCATCTT CTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為241 bp (引物序列設(shè)計(jì)合成均由Invitrogen公司完成)。反應(yīng)體系50 μl，含cDNA 模板1 μl，10×buffer 5 μl，2.5 mmol·L-1MgCl23 μl，2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μl，RRM2上、下游引物各1 μl，β-actin 上、下游引物各1 μl，Taq DNA聚合酶0.25 μl，滅菌水補(bǔ)至50 μl。反應(yīng)條件為: 預(yù)變性94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。q-PCR產(chǎn)物以20 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳后，觀察結(jié)果及照相，并應(yīng)用Gelpro分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描，檢測(cè)各組RRM2 mRNA q-PCR產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參β-actin mRNA q-PCR 產(chǎn)物的A值，并將A(RRM2) /A(β-actin)的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.8Western blot檢測(cè)RRM2蛋白表達(dá)的變化 收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h及未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞，用適量裂解液裂解，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，上樣50 μg總蛋白，10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，4 ℃封閉過(guò)夜后，與RRM2一抗( 1∶2 000 稀釋)和GAPDH一抗( 1∶5 000稀釋)在37 ℃孵育4 h，TBST洗滌15 min×3次，加入RRM2二抗( 1∶100 000 稀釋)和GAPDH二抗( 1∶5 000 稀釋)，37 ℃孵育2 h，TBST洗滌15 min×3次，ECL發(fā)光試劑對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，X膠片曝光，拍照，對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描，檢測(cè)各組RRM2蛋白和內(nèi)參GAPDH所對(duì)應(yīng)條帶A值，然后將A(RRM2)/A(GAPDH)的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.9細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定 收集轉(zhuǎn)染48 h及未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105ml-1，用matrigel鋪蓋于transwell小室的上下室之間的8 μm孔徑的PVP多孔濾膜上，100 μl matrigel/膜,37℃ 0.5h。于transwell小室的下室加入0.8 ml趨化劑，上室中加入各組細(xì)胞懸液100 μl，37 ℃體積分?jǐn)?shù)5 %CO2培養(yǎng)24 h，取出濾膜，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇固定10 min，常規(guī)作0.1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)于顯微鏡下取上、下、左、右、中心5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取每個(gè)視野的平均數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染后48 h Ishikawa/RRM2-siRNA組見(jiàn)有綠色熒光細(xì)胞，約占細(xì)胞總數(shù)的40 %(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)(×200)

Fig 1 The transfection efficiency of Ishikawa cells was detected by fluorescene microscope (×200)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及凋亡率情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h的轉(zhuǎn)染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h的轉(zhuǎn)染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA及Ishikawa/RRM2-siRNA 3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中Ishikawa/RRM2-siRNA的轉(zhuǎn)染率明顯高于其它兩組。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡率結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h的凋亡率差異則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ishikawa/Negative-siRNA及Ishikawa/RRM2-siRNA細(xì)胞的凋亡率較Ishikawa組明顯升高，其中Ishikawa/RRM2-siRNA的凋亡率最高。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞凋亡率的比較

Fig 2 The transfection efficiency, apoptotic rate of three groups (Ishikawa, Ishikawa/Negative-siRNA，Ishikawa/RRM2-siRNA) were measured by flow cytometry

2.3 siRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染48 h對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期分布的影響:流式細(xì)胞分析表明，Ishikawa/RRM2-siRNA細(xì)胞G1期(DNA合成前期)的細(xì)胞比例由對(duì)照Ishikawa組的(51.08±0.67)% 增至(81.35 ±0.47)%，與Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ishikawa/RRM2-siRNA與Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA比較S期和G2期(DNA合成期與DNA合成后期)細(xì)胞比例降低。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化

Fig 3 Cell cycles were measured by flow cytometry

2.4 MTT比色法檢測(cè)增殖情況

MTT數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染48 h和72 h細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA及Ishikawa/RRM2-siRNA 3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以Ishikawa/RRM2-siRNA增殖最緩慢，其生長(zhǎng)抑制率為61.78%。見(jiàn)圖4。

圖4 MTT比色法檢測(cè)siRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

Fig 4 The proliferation ability of Ishikawa cells was detected by MTT colorimetry

2.5 siRNA對(duì)RRM2 mRNA表達(dá)水平的影響

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，同一時(shí)間段內(nèi)各組泳道中細(xì)胞內(nèi)源β-actin 基因片段條帶的亮度強(qiáng)弱相似，說(shuō)明q-PCR 中加入模板的量基本一致，而擴(kuò)增的RRM2基因電泳帶存在差異。各組ARRM2mRNA/Aβ-actin的統(tǒng)計(jì)分析顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h RRM2 mRNA表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染48 h和72 h RRM2 mRNA表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Ishikawa組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組RRM2 mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，與MTT法檢測(cè)結(jié)果一致。見(jiàn)圖5。

圖5 q-PCR檢測(cè)siRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞RRM2 mRNA表達(dá)的影響

Fig 5 The RRM2 mRNA expression in Ishikawa cell(a,b,c, three groups) was detected by q-PCR after transfected siRNA

2.6 siRNA對(duì)RRM2蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot分析結(jié)果顯示，同一時(shí)間段內(nèi)的GAPDH蛋白條帶亮度幾乎無(wú)差異，而轉(zhuǎn)染RRM2-siRNA組的細(xì)胞靶基因蛋白表達(dá)減少。各組ARRM2/AGAPDH的比值統(tǒng)計(jì)分析顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h后細(xì)胞RRM2的蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h后細(xì)胞RRM2的蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ishikawa/RRM2-siRNA與Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA相比，RRM2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。 見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)siRNA對(duì)Ishikawa細(xì)胞RRM2蛋白表達(dá)的影響

Fig 6 The RRM2 protein in three groups cell(a,b,c) were detected by Western blot

2.7 細(xì)胞侵襲能力的比較

侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，Ishikawa/Negative-siRNA組與Ishikawa對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ishikawa/RRM2-siRNA組與之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，即RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后其穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。見(jiàn)圖7。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是國(guó)內(nèi)外女性生殖道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的生命健康，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的最主要原因。與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系生物大分子RRM2是目前腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)與重點(diǎn)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，希望通過(guò)阻斷RRM2的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，提高腫瘤的治愈率和治療效果。RNA干擾是臨床上阻斷基因表達(dá)較好的技術(shù)之一。

圖7 轉(zhuǎn)染48 h后各組侵襲能力的比較

Fig 7 Ability of cells invasion was detected with transwell chamber model after cells(a,b,c three groups) transfected 48 h

RNAi 是通過(guò)內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (dsRNA) 誘發(fā)的mRNA 水平上的基因沉默，具有高度特異性[6-10]。siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性RNAi作用，在細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生小發(fā)夾RNA( short hairpin RNA，shRNA)，可延長(zhǎng)沉默作用時(shí)間[11]，并且可以針對(duì)多個(gè)基因或基因家族的共有序列來(lái)抑制多個(gè)基因的表達(dá)。對(duì)腫瘤細(xì)胞關(guān)鍵性基因的mRNA進(jìn)行干擾，可有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)以RRM2 為靶標(biāo)，根據(jù)siRNA 的設(shè)計(jì)原則[12]，參考文獻(xiàn)[5]，在體外合成siRNA，探討siRNA 技術(shù)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa RRM2表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)能力和侵襲能力的影響，為siRNA 技術(shù)在基因治療中的進(jìn)一步應(yīng)用，提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

首先，我們確認(rèn)了Ishikawa/RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染的效率。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的細(xì)胞綠色熒光。轉(zhuǎn)染后48 h Ishikawa/RRM2-siRNA組見(jiàn)有綠色熒光細(xì)胞，約占細(xì)胞總數(shù)的40 %，即轉(zhuǎn)染后48 h Ishikawa/RRM2-siRNA的轉(zhuǎn)染率約40%。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，轉(zhuǎn)染48 h后Ishikawa/RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染率明顯增高，繼續(xù)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間到72 h轉(zhuǎn)染率無(wú)明顯差異，故48 h是最佳的轉(zhuǎn)染時(shí)間。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇24、48、72 h為檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的時(shí)間點(diǎn)較為合理，這與Cui等[13-14]報(bào)道的時(shí)間點(diǎn)一致。

RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染成功，那么RRM2的表達(dá)是否有改變？本實(shí)驗(yàn)用半定量q-PCR和Western blot分別檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞RRM2在mRNA和蛋白水平上表達(dá)的變化。不同轉(zhuǎn)染時(shí)間比較顯示，RRM2無(wú)論在mRNA或蛋白水平上的表達(dá)，轉(zhuǎn)染24 h和48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而48 h和72 h差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明轉(zhuǎn)染達(dá)到一定時(shí)間后，繼續(xù)增加轉(zhuǎn)染時(shí)間并不能增強(qiáng)干擾作用。與對(duì)照組及錯(cuò)義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組能顯著地降低RRM2的mRNA及蛋白表達(dá)，即siRNA可特異性地抑制Ishikawa細(xì)胞RRM2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，提示本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的siRNA可成為干擾RRM2表達(dá)的有效工具，為以后應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供了理論依據(jù)。

RRM2的mRNA及蛋白表達(dá)被抑制，那么細(xì)胞的生物學(xué)行為是否變化？本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡的情況以及細(xì)胞周期的改變，采用MTT法檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞體外增殖情況，采用Transwell小室檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞的體外侵襲能力。

轉(zhuǎn)染48 h后Ishikawa細(xì)胞周期分布顯示，Ishikawa/RRM2-siRNA細(xì)胞G1期的細(xì)胞比例由對(duì)照Ishikawa組的(51.08±0.67)%增至(81.35±0.47)%，與對(duì)照組、錯(cuò)義序列組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Ishikawa/RRM2-siRNA組S期和G2期(DNA合成期與DNA合成后期)細(xì)胞比例相對(duì)于另外兩組出現(xiàn)明顯的降低，說(shuō)明了Ishikawa/RRM2-siRNA可將Ishikawa細(xì)胞阻斷于G1期，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，Ishikawa細(xì)胞體外增殖有時(shí)間上的差異，轉(zhuǎn)染24 h和48 h有明顯的差異，而48 h和72 h無(wú)明顯的差異。與對(duì)照組、錯(cuò)義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA增殖最緩慢，其轉(zhuǎn)染48 h的生長(zhǎng)抑制率為62.78%，說(shuō)明轉(zhuǎn)染RRM2-siRNA 48 h生長(zhǎng)抑制達(dá)到高峰，繼續(xù)延長(zhǎng)到72 h其抑制作用無(wú)明顯增強(qiáng)，而且有所恢復(fù)。以上結(jié)果表明，RRM2-siRNA在一定時(shí)間內(nèi)可有效地抑制Ishikawa細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖作用，RRM2-siRNA抑制作用在轉(zhuǎn)染后48 h最強(qiáng)。以上這些結(jié)果起因于RRM2是DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵限速酶[1]，RRM2表達(dá)下降，細(xì)胞DNA合成水平下降，所以Ishikawa細(xì)胞被阻斷于G1期，不能進(jìn)行有絲分裂。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48 h后，Ishikawa細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)明顯的凋亡，當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)到72 h后，凋亡細(xì)胞進(jìn)一步地增多。與對(duì)照組及錯(cuò)義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組凋亡率最高。以上結(jié)果表明，當(dāng)轉(zhuǎn)染率增高時(shí)，凋亡細(xì)胞也相應(yīng)的增加，并且隨著時(shí)間的推移凋亡越來(lái)越明顯。這可能與ds-siRNA的含量有關(guān)，轉(zhuǎn)染率越高，siRNA的含量越高，在一定時(shí)間內(nèi)沉默mRNA作用可能越強(qiáng)。RRM2表達(dá)水平降低所導(dǎo)致的Ishikawa 細(xì)胞凋亡與NF-κB活性降低有關(guān)。Duxbury等[5]以表達(dá)RRM2特異性siRNA(psiRRM2)的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)RRM2的PANC1、MIAPaCa2、BxPC3和Capan2細(xì)胞,結(jié)果顯示psiRRM轉(zhuǎn)染體NF-κB活性、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)及活性較psiControl 轉(zhuǎn)染體降低。這說(shuō)明特異性siRNA通過(guò)降低RRM2表達(dá)破壞NF-κB信號(hào)通路。因NF-κB是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，所以它的活性降低導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。

采用Transwell小室檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞的體外侵襲能力實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與對(duì)照組及錯(cuò)義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，說(shuō)明RRM2-siRNA能有效地降低Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力。此現(xiàn)象的產(chǎn)生與MMP-9表達(dá)的降低有關(guān)。Vickers等[12，14]發(fā)現(xiàn)，psiRRM2可下調(diào)MMP-9的表達(dá)?；|(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的決定者，其中MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中分子質(zhì)量最大的酶，活化后可降解細(xì)胞基底膜屏障，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。所以RRM2-siRNA導(dǎo)致Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力的降低有可能是MMP-9表達(dá)降低所介導(dǎo)。此方法將來(lái)也可聯(lián)合化療藥物，能更有效地抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、侵蝕和轉(zhuǎn)移。

總之，RRM2的過(guò)度表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，且能夠通過(guò)siRNA阻斷其表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤的侵蝕、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的。

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Effect of siRNA inhibiting expression of RRM2 on Ishikawa cell proliferation

XUN Qing-ying1，WANG Ling-ling2，ZHOU Huai-jun2

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，NanjingDrumTowerHospital，NanjingUniversityMedicalSchool，Nanjing210008，China)

Objective: To observe the influence of siRNA on Ishikawa cell proliferation and invasion using small interfering RNA(siRNA) to knockdown RRM2 expression in endometrial cancer cell line Ishikawa.Methods:siRNA targeting RRM2 gene was designed and prepared to form ds-siRNA，then ds-siRNA was transfected into Ishikawa cells with Lipofectamine2000TM. The result of transfection was evaluated by fluorescence microscope. The transfection efficiency，apoptotic rate and cell cycle were measured by flow cytometry. The proliferation ability of Ishikawa cells was detected by MTT colorimetry. The expression of RRM2 on mRNA and protein level was analyzed by q-PCR and Western blotting respectively. The ability of cells invasion was detected with transwell chamber model.Results:The siRNA targeting human RRM2 gene effectively inhibited the proliferation and invasion of Ishikawa cells，induced cell apoptosis，increased cell counts in phase G1and decreased in S and G2phase，and decreased the expression of RRM2 on both mRNA and protein level. But these effects did not appear in scrambled siRNA (Ishikawa/Negative-siRNA) control group.Conclusion:RRM2 expression is reduced by siRNA targeting human RRM2 gene，which results the inhibition of Ishikawa cells proliferation and invasion，thus apoptosis and growth retardation are inducedinvitro．

siRNA; RRM2 gene; endometrial cancer; Ishikawa cell

2015-09-10

2015-10-10

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20151096);江蘇省人事廳六大人才高峰項(xiàng)目(WSW-021);南京市衛(wèi)生局重點(diǎn)項(xiàng)目(ZKX09023);南京市衛(wèi)生局青年人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目(QRX11019)

尋慶英(1966-)，女，山東金鄉(xiāng)人，講師，在讀博士研究生。E-mail:xqyzhou@126.com

周懷君 E-mail:zhouhj2007@126.com

尋慶英，王玲玲，周懷君.siRNA抑制RRM2表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖影響的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：890-896.

R730.54; R737.33

A

1671-6264(2015)06-0890-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．007