由繼紅，陸靜梅，費虹天

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

前紅松和紅松的系統(tǒng)比較研究

由繼紅，陸靜梅，費虹天

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

從結(jié)構(gòu)植物學(xué)、植物生物化學(xué)、分子生物學(xué)三個方面對紅松和前紅松進行了系統(tǒng)的比較研究.結(jié)果表明：前紅松葉的角質(zhì)層內(nèi)表面的胞間凸緣為淺波浪狀，緣厚；紅松葉的角質(zhì)層內(nèi)表面的胞間凸緣為深波浪狀，緣窄.過氧化物同工酶電泳結(jié)果可見，前紅松有8條酶帶，紅松有7條酶帶；前紅松的酯酶同工酶電泳有6條酶帶，紅松的酯酶同工酶電泳有5條酶帶.前紅松與紅松葉綠體基因組中的rbcL基因片段458個核苷酸中有5個不同.

前紅松；紅松；角質(zhì)層；過氧化物同工酶；酯酶同工酶；葉綠體基因rbcL

紅松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.）是松屬中一個古老的樹種，天然分布中心在中國的小興安嶺和長白山林區(qū)，俄羅斯東南部、朝鮮北部和日本本州中部山地也有部分分布［1］.前紅松（Pinus prokoraiensis Y.T.Zhao，J.M.Lu，et A.G.Gu.）是松屬中一個新種，也是一個珍稀樹種，現(xiàn)僅存于中國吉林鐵路局的土門嶺林場，它具有生長快、抗鹽堿性強等優(yōu)點［2－3］.

前紅松與紅松形態(tài)相似，極易混淆，為了澄清其區(qū)別，陸靜梅等研究了前紅松和紅松莖、葉解剖結(jié)構(gòu)上的差別［4－7］.但有關(guān)前紅松和紅松葉的角質(zhì)層、生理生化及分子生物學(xué)，特別是基因的核苷酸序列方面的研究未見報道.本文從這幾方面對二者進行了系統(tǒng)的比較研究，以為前紅松與紅松的區(qū)別提供新的依據(jù).

1 材料和方法

1.1實驗材料

紅松取自吉林省輝南縣三角龍灣，地理位置為東經(jīng)126°24′、北緯42°26′，海拔833m；前紅松取自吉林省土門嶺林場，地理位置為東經(jīng)126°02′、北緯44°06′，海拔260m.

1.2實驗方法

1.2.1 葉角質(zhì)層內(nèi)表面的觀察

取胸徑為20cm的前紅松與紅松的成熟葉片制備角質(zhì)層樣品［8］.角質(zhì)層經(jīng)不同濃度的乙醇脫水、干燥后，內(nèi)表面向上粘在樣品臺上；IB－3離子濺射儀鍍20nm厚的金膜.用日本產(chǎn)S－570型掃描電子顯微鏡觀察并照相，電壓20kV.

1.2.2 同工酶電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法.各選5株植株，10年樹齡，選取位置、葉齡相同的幼葉，用0.05mmol／L pH＝7.5的磷酸緩沖液冰浴研磨，于4℃條件下，11 000r／min離心20min，取上清液用于實驗.過氧化物酶同工酶電泳的濃縮膠濃度為3.5%，分離膠濃度為6.5%，用聯(lián)苯胺法染色［9］；酯酶同工酶電泳所用濃縮膠濃度為3.6%，分離膠濃度為7.5%，參照文獻［10］的方法進行染色.用過硫酸銨

誘導(dǎo)凝膠聚合，Tris－甘氨酸緩沖液作為電極緩沖液.電泳各重復(fù)3次.酶帶的遷移率＝分離膠起點到酶

帶中心的距離／分離膠起點到前沿指示劑中心的距離.

1.2.3 分子生物學(xué)實驗

取嫩葉用CTAB法提取總DNA.通過PCR反應(yīng)擴增基因片段.20μL反應(yīng)混合液中含有：DNA模板50ng，200μmol／L dNTP，引物各0.5μmol／L，TaqDNA酶1U.PCR反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9600反應(yīng)儀（美國）上進行.擴增產(chǎn)物用ABI 373DNA測序儀進行測序.

擴增rbcL基因片段所用引物及反應(yīng)條件：引物：F：5′－CAG CAG CTA GTT CAG GAC TC－3′；R：5′－ACA ATG GCC TAC TTC TTC AC－3′.反應(yīng)條件：變性：94℃，3min.退火：94℃，50s；58℃，50s；72℃，80s，30個循環(huán).延伸：72℃，5min.

2 結(jié)果與分析

2.1葉角質(zhì)層結(jié)構(gòu)

前紅松和紅松葉的角質(zhì)層內(nèi)表面的電子顯微鏡結(jié)構(gòu)見圖1.前紅松角質(zhì)層的胞間凸緣厚，淺波浪狀，表面的突起小、少，內(nèi)表面的細條紋狀雕紋連成網(wǎng)狀；紅松角質(zhì)層的胞間凸緣薄，深波浪狀，表面的突起大、多，無細條紋狀雕紋.

2.2過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶電泳結(jié)果

5株前紅松相同部位幼葉的同工酶電泳結(jié)果表明，無論是過氧化物酶、還是酯酶，不同植株間無差異；5株紅松幼葉的實驗結(jié)果也是如此.過氧化物酶同工酶電泳結(jié)果如圖2所示，前紅松有8條酶帶，紅松有7條酶帶.二者的同工酶譜帶可分為3個區(qū).Ⅰ區(qū)：紅松有4條酶帶，前紅松有5條酶帶；Ⅱ區(qū)：紅松與前紅松都有2條酶帶；Ⅲ區(qū)：前紅松、紅松各有1條酶帶.

前紅松與紅松的酯酶同工酶電泳結(jié)果見圖3.由圖3可見，前紅松有6條酶帶，紅松有5條酶帶.Ⅰ區(qū)：前紅松和紅松各有1條酶帶；Ⅱ區(qū)：前紅松有4條酶帶，紅松有3條酶帶；Ⅲ區(qū)：前紅松和紅松各有1條酶帶.

2.3分子生物學(xué)實驗結(jié)果

隨機取5株紅松和前紅松個體，分別測定其rbcL基因片段的核苷酸序列，結(jié)果見圖4.結(jié)果表明，同種個體間rbcL基因片段的核苷酸序列無差別，但前紅松和紅松間有差別，458個核苷酸中有5個不同.

3 討論

區(qū)別形態(tài)特征相似的植物，從傳統(tǒng)的角度來研究主要是根據(jù)花、葉、莖、果實、種子等外部形態(tài)特征上的差異，像本文所采用的將植物解剖學(xué)、生理及生物化學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)結(jié)合，從不同層次、不同角度來系統(tǒng)比較研究的方法尚沒有見過報道.

角質(zhì)層最早在甘藍葉上證實存在［11］.它位于植物表皮細胞外壁的外面，多數(shù)植物角質(zhì)層的表面平滑，但也有具有褶狀或脊?fàn)顥l紋的角質(zhì)層.角質(zhì)層能夠降低植物體內(nèi)水分的蒸發(fā)，保護植物不被微生物等侵染，重要的是它還被應(yīng)用于植物分類學(xué)的研究中.人們不但用光學(xué)顯微鏡對角質(zhì)層的表面結(jié)構(gòu)進行了大量研究，而且，還采用電子顯微鏡對角質(zhì)層的內(nèi)表面做了許多探討.通過角質(zhì)層對許多不同植物類群進行分類學(xué)等的研究，植物葉角質(zhì)層的特征在古植物學(xué)和分類學(xué)中的價值已得到普遍認(rèn)同［12－13］，角質(zhì)層是個體鑒定可靠的指標(biāo)［14－15］.

研究表明，松科9個屬的葉角質(zhì)層內(nèi)表面的胞間凸緣和雕紋在屬下分類上有重要意義［16］；冷杉屬植物葉角質(zhì)層內(nèi)表面的胞間凸緣特征差異顯著［17］.用電子顯微鏡對松屬針葉角質(zhì)層內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)進行觀察，可發(fā)現(xiàn)不同種胞間凸緣的特征差異顯著［18］.本實驗結(jié)果顯示，前紅松與紅松的角質(zhì)層內(nèi)表面的胞間凸緣有明顯區(qū)別，在顆粒狀突起以及條狀雕紋方面也存在差異.

同工酶廣義來講是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)但其結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)不同的一組酶.同工酶的發(fā)現(xiàn)和分析方法的改進，使其廣泛應(yīng)用于分類學(xué)等學(xué)科中.當(dāng)植物種依據(jù)形態(tài)特征難以區(qū)分時，往往多采用同工酶的方法.過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶是在分類學(xué)中應(yīng)用最多的酶.過氧化物酶是活性較高的一種氧化酶，是由一個鐵卟啉輔基和單一肽鏈相結(jié)合而構(gòu)成的血紅素蛋白，其對過氧化氫具有專一性.該酶廣泛存在于植物體中，具有多種功能，參與植物體內(nèi)多種代謝過程，與植物的抗性密切相關(guān)，在活性氧代謝過程中具有重要作用.酯酶是催化酯類化合物水解的酶，它催化水解物質(zhì)的酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵，參與植物體內(nèi)的多種代謝反應(yīng)，如磷的代謝、細胞壁的合成等.大量研究表明，過氧化物酶和酯酶能夠用來區(qū)別不同的植物種［19－20］.我們的實驗結(jié)果顯示，前紅松與紅松的過氧化物酶同工酶電泳酶譜及酯酶酶譜在同工酶帶數(shù)及遷移率方面明顯不同，反映了前紅松與紅松在同工酶方面存在著差異.

分子生物學(xué)認(rèn)為，生物千差萬別的根本區(qū)別在于蛋白質(zhì)的氨基酸順序，其信息儲存于DNA的序列中［21］.對基因序列的比較研究能夠為系統(tǒng)學(xué)的研究提供直接和有力的證據(jù)［22］.

葉綠體DNA很保守，倒置重復(fù)區(qū)更加保守［23］，所以，人們對葉綠體DNA進行了許多研究［24］.其中，有關(guān)葉綠體基因組中的rbcL基因研究的最多，已被應(yīng)用于系統(tǒng)學(xué)研究中［25］.rbcL基因是編碼核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶大亞基的基因，由葉綠體基因組編碼，特別適合植物系統(tǒng)學(xué)研究［26］.核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶是植物光合作用C3途徑中固定二氧化碳的關(guān)鍵酶，也是植物光呼吸反應(yīng)過程的關(guān)鍵酶，由8個大亞基和8個小亞基組成，對提高植物的光合作用效率有重要意義.用rbcL基因?qū)︸R尾樹科［27］、木蘭亞綱［28］、松科［29］、芍藥［30］等做的系統(tǒng)學(xué)研究，所得結(jié)果很好地解決了經(jīng)典分類的相關(guān)問題.

本文分別對前紅松與紅松的rbcL基因進行了測序、比較，結(jié)果表明前紅松與紅松的該基因序列存在差異.

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A systematic comparative study of P.prokoraiensis Y.T.Zhao，J.M.Lu et A.G.Gu and P.koraiensis Sieb.et Zucc.

YOU Ji－h(huán)ong，LU Jing－mei，F(xiàn)EI Hong－tian

（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

Systematic comparative studied on P.prokoraiensis and P.koraiensis from three aspect of structural botany，plant biological chemistry and molecular biology in this paper.Those results：the intercellular flanges of the needle cuticle of P.prokoraiensis is shallow undulate and developed single flange，P.koraiensis’s intercellular flanges is deep undulate and not prosperous single flange.The electrophoresis of peroxidase isozyme in P.prokoraiensis was 8isozyme bands，P.koraiensis’s electrophoresis was 7isozyme bands.The electrophoresis of esterase isozyme in P.prokoraiensis was 6isozyme bands，P.koraiensis’s electrophoresis was 5isozyme bands.The nucleotide sequences for rbcL gene are different between P.koraiensis and P.prokoraiensis by 5nucleotides in a 458bp fragment.These results afford new gist for different of P.koraiensis and P.prokoraiensis.

Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.；P.prokoraiensis Y.T.Zhao，J.M.Lu et A.G.Gu；cuticle；peroxidase isozyme；esterase isozyme；chloroplast rbcL gene

Q 944.53 ［學(xué)科代碼］ 180·5130 ［

］ A

（責(zé)任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0119－05

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.022

2014－05－07

國家自然科學(xué)基金資助項目（41271231）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20120270）.

由繼紅（1965—），男，博士，高級工程師，主要從事結(jié)構(gòu)植物學(xué)研究.