董 俊，戴良英，易圖永

（1. 湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128；2. 植物疾病控制與利用湖南省高校重點實驗室，長沙 410128；3. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128）

湖南省柑橘黃龍病菌M94319和16SrRNA序列的擴增和分析

董 俊1,2,3，戴良英1,2,3，易圖永1,2,3

（1. 湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128；2. 植物疾病控制與利用湖南省高校重點實驗室，長沙 410128；3. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128）

為了研究柑橘黃龍病菌是否存在遺傳分化現(xiàn)象，對采自湖南、江西、福建等3個省的20多個縣（市）的柑橘黃龍病樣品，提取了總DNA，并對16S rDNA和M94319基因序列進行了PCR擴增、測序，通過MEGA5.0生物信息學軟件對這些序列進行了分析。結果表明，在柑橘潰瘍病遺傳多樣性分析過程中M94319基因序列的分辨率比16S rRNA高，即M94319基因序列基因片段能有效地檢測出黃龍亞洲種，16S rRNA區(qū)分不了各個小種。

柑橘黃龍?。贿z傳多樣性；16S rDNA；M94319

柑橘黃龍病在柑橘生產中是最難防治、危害巨大的一種毀滅性病害[1]，至今沒有能完全治愈發(fā)病植株的特效藥[2]，被稱做柑橘的癌癥。目前，柑橘黃龍病已成為柑橘產業(yè)的最大障礙，它不僅危害著廣大柑橘種植者的利益，也嚴重威脅著柑橘產業(yè)的發(fā)展[3]。隨著柑橘種植技術的大力推廣和政府的扶持，以及全球氣候變暖，柑橘黃龍病的發(fā)生區(qū)域仍在逐年增多[4]。

16S rDNA在細菌分類中應用非常廣泛，其高度的保守性和穩(wěn)定性使之成為了分子生物學研究的一個熱點[5]。根據(jù)該序列片段設計OI1/OI2引物來進行黃龍病的檢測[6]。但隨著近年來不斷的深入研究發(fā)現(xiàn)了16S rDNA在分類上的一些缺點，其數(shù)據(jù)庫還不完整，在分析親緣關系較近的小種時難以達到要求[7]。M94319基因序列是黃龍病致病菌一段保守性較好，長度適中的基因片段。暫時關于該片段的報道與記載還不多，但該序列是柑橘黃龍病亞洲種病原菌特有的基因片段，根據(jù)其序列設計的TL/TR引物對湖南及其周邊地區(qū)的黃龍病檢測效果非常好，其對于黃龍病研究的作用與意義還有待進一步的開發(fā)[8-9]。為了解柑橘黃龍病在湖南省的分布情況、傳播特點、種群差異及建立柑橘黃龍病綜合防治示范區(qū)[10]，對湖南省的零陵區(qū)、江華縣、江永縣、道縣、宜章縣、資興市等20多個縣（市），以及江西省的大余縣、信豐縣，福建省泉州市的疑似樣品進行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用北京全式金生物技術有限公司的植物DNA提取試劑盒（EasyPuer?Plant Genomic DNA Kit）提取柑橘葉片總DNA，將提取的DNA保存在冰箱-20℃保存，并選取用檢測柑橘黃龍病菌的特異引物PCR擴增測序后呈陽性的DNA抽提液（DX01、DX12、JY09、LL16、JH07、LW14、YZ05、BH02、ZX18、RC17、YX07、XF04、XF06、DY02、DY05、FJ02、FJ03），用以擴增16S rDNA。樣品來自湖南、江西、福建3個省的22個縣（市）及地區(qū)，基本涵蓋了湖南省柑橘黃龍病的主要發(fā)病地區(qū)，還有同地區(qū)不同寄主的的帶病樣品，可以大致反映湖南地區(qū)柑橘黃龍病的分化情況及其與周邊省份的遺傳距離。

1.2 引物的選擇

通過不同退火溫度梯度的設置和其他PCR擴增的條件探索中發(fā)現(xiàn)OI1/OI2與TL/TR引物能夠共用同一套PCR反應體系與參數(shù)，具體反應體系和反應參數(shù)如下：

PCR反應體系（50 μL）：模板DNA2.5μL，F(xiàn)orward Primer1.0μL，Reward Primer 1.0μL，10×PCR Buffer4.0μL，dNTPs3.0μL，Tap DNA聚合酶0.5μL，雙蒸H2O 38μL；PCR反應參數(shù)：裂解94℃ 5 min，變性94℃40 s，退火56℃40 s，延伸72℃ 1 min，35個循環(huán)，延伸72℃ 7 min，保存4℃。

PCR擴增結果與陽性對照保持一致的樣品送至上海生工或長沙鉑尚測序，同種引物的測序結果用系統(tǒng)發(fā)生軟件MEGA5.0進行聚類分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)病區(qū)域

通過各個地區(qū)樣品的PCR擴增檢測及測序結果顯示以下地區(qū)的樣品中有感染了柑橘黃龍病的陽性植株，整理結果如表1所示。

2.2 16S rDNA引物擴增結果

采用16S rDNA序列引物OI1/OI2對表4中的17個陽性樣品進行PCR擴增，擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示。

圖1中的1～17號分別對應檢測編號的DX01、DX12、JY09、LL16、JH07、LW14、YZ05、BH02、ZX18、RC17、YX07、XF04、XF06、DY02、DY05、FJ02和FJ03，測序結果用系統(tǒng)發(fā)生軟件MEGA5.0進行聚類分析，分析結果見圖2。

從圖2中可以看出，16S rDNA序列引物可以將3個省的17個樣品大致分為5簇，DX12、JY09、LL16、LW14、BH02、DX01和JH07為 第 一 簇；YZ05、ZX18、RC17、YX07和XF06為 第 二 簇；DY02為第三簇；DY05、XF04為第四簇；FJ02和FJ03為第五簇。第一簇包括永州市的5個樣品及郴州臨武縣、北湖區(qū)的樣品，位置主要是湖南省的西南部；第二簇包括郴州4個樣品及信豐縣（贛南臍橙），位置在湖南省東南部及江西省西南部；大余縣的溫州蜜桔單獨為第三簇；第四簇包括大余縣（椪柑）和信豐縣（砂糖柑）兩個樣品；第五簇則為福建的兩個樣品。

2.3 M94319序列引物擴增結果

采用M94319序列引物TL/TR對17個陽性樣品進行PCR擴增，擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖3所示：

圖3中的1～17號分別對應樣品的DX01、DX12、JY09、LL16、JH07、LW14、YZ05、BH02、ZX18、RC17、YX07、XF04、XF06、DY02、DY05、FJ02、FJ03，測序結果用系統(tǒng)發(fā)生軟件MEGA5.0進行聚類分析。

從圖4可以看出，M94319序列引物TL/TR將湖南、江西、福建的17個陽性樣品分為5簇，LL16、DX12、LW14、JH07、BH02和JY09為一簇；YX05、DX01、ZX05、YX07、XF06和RC17為第二簇；DY02和XF04分別為單獨的一簇（第三、四簇）；DY05、FJ02、FJ03為第五簇。第一簇主要是湖南西南部地區(qū)，包括了零陵區(qū)、道縣（琯溪蜜柚）、臨武縣、江華縣、北湖區(qū)的樣品；第二簇主要是湖南省東南部，包括了宜章、道縣（臍橙）、資興市、永興縣、汝城縣及江西信豐縣（贛南臍橙）；江西省大余縣（溫州蜜桔）和信豐縣（砂糖柑）分別為單獨的一簇，第五簇包括了江西省大余縣（椪柑）及福建省的兩個樣品。

3 小 結

從20世紀80年代開始至今，黃龍病在整個湖南省的發(fā)病范圍逐步擴大，柑橘木虱的生活地區(qū)也在逐年增多，發(fā)病地已從少數(shù)零星地區(qū)蔓延到了湖南省的幾乎整個南部和西南大部分地區(qū)，造成了巨大的經濟損失，嚴重制約了柑橘產業(yè)的發(fā)展[11]。使用16S rDNA及M94319序列設計的引物對湖南、江西、福建的樣品進行檢測并分析其遺傳多樣性[12]，并在發(fā)病嚴重的零陵區(qū)建立綜合防治示范區(qū)進行綜合防控的研究。所得到的數(shù)據(jù)基本可以反映出湖南省黃龍病病菌之間及其與江西、福建兩省的遺傳分化距離，大量綜合防控的工作，這些都對該病害的鑒定及綜合治理具有一定的指導意義。

兩種引物對湖南、江西、福建這三個省的17個陽性樣品的DNA進行PCR擴增后用系統(tǒng)發(fā)生軟件MEGA5.0進行聚類分析[13]，16S rDNA擴增的目標片段約為1160 bp，M94319引物擴增目標片段約為560 bp。兩圖均表明樣品來源的地域差異是造成分化的主要原因，寄主作物品種的差別也是造成遺傳分化的重要因素之一，湖南省內的柑橘黃龍病病原菌的遺傳分化較小，江西贛州市與湖南地區(qū)的親緣關系也較近，福建地區(qū)黃龍病病原菌和湖南地區(qū)的遺傳差距最大。

16S rDNA和M94319基因序列構建的柑橘黃龍病系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出兩者的相同性較高， 17個黃龍病陽性樣品分為五簇，但是16S rDNA的引物OI1/OI2只能鑒定出柑橘黃龍病的病原菌，鑒定病原菌的小種時該序列不能直觀反映出其差異性[14]。M94319基因是柑橘黃龍病亞洲種的片段，其引物TL/TR能夠很好的分析出病原菌的小種，對湖南省的病原菌種類分析要好于16S rDNA的引物OI1/OI2。

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（責任編輯：石 君）

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（責任編輯：石 君）

Amplification and Analysis of M94319 and 16SrDNA Sequence of Citrus Huanglongbing in Hunan

DONG Jun1,2,3，DAI Liang-ying1,2,3，YI Tu-yong1,2,3

（1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Colleges Key Laboratory of Control and Utilization of Plant Disease, Changsha, 410128, PRC; 3. Hunan Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Pests, Changsha 410128, PRC）

In order to study whether citrus Huanglongbing pathogen has the phenomenon of genetic differentiation, samples with citrus Huanglongbing were collected from more than 20 counties (cities) in Hunan, Jiangxi and Fujian, the total DNA was extracted, 16S rDNA and M94319 gene sequence were amplifed by PCR and sequenced, and the sequencing results were analyzed with the bioinformatics software MEGA5.0. The results showed that M94319 gene sequence had higher resolution than 16S rDNA in the analysis of genetic diversity, which indicated that the fragment of M94319 gene sequence could effectively detect Huanglong Asian species, and 16S rDNA could not distinguish races.

citrus Huanglongbing; genetic diversity; 16S rDNA; M94319

S436.66

A

1006-060X（2015）08-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.001

2015-06-20

農業(yè)部公益行業(yè)計劃（201003067）

董 ?。?989-），男，湖南常德市人，碩士研究生，研究方向為植物病理。

易圖永