趙琰明，朱家穎，澤桑梓，趙 寧，楊 斌＊

（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.云南省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 650224）

生物體在生命活動(dòng)過程中，特別是在逆境脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生多種活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫和羥自由基等［1］。這些活性氧具有很強(qiáng)的氧化能力，當(dāng)他們?cè)谏矬w內(nèi)過量積累時(shí)可造成機(jī)體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷，對(duì)生物體有很大危害［2］。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體各組織，在機(jī)體抗氧化和免疫過程中起著重要作用。它與過氧化氫酶以及過氧化物酶共同組成了保護(hù)酶系統(tǒng)［3］。當(dāng)機(jī)體內(nèi)活性氧大量積累時(shí)，SOD 就會(huì)被大量誘導(dǎo)生成，催化活性氧發(fā)生歧化反應(yīng)，生成水和過氧化氫［4］。它是唯一能夠特異性清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶，平衡機(jī)體的氧自由基，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用［5-6］。超氧化物歧化酶按照金屬輔基主要分為Fe-SOD、Mn-SOD 和Cu／Zn-SOD 3種，其中銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)分布相對(duì)廣泛，也是目前為止研究最多的超氧化物歧化酶［7］。已有研究表明銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)有胞內(nèi)形式（icCu／Zn-SOD）和胞外形式（ec-Cu／Zn-SOD）兩種［8］。

云南切梢小蠹（Tomicusyunnanensis）是鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹屬（Tomicus）嚴(yán)重為害多種松樹的次期性蛀干害蟲［9-10］。該害蟲入侵寄主后寄主會(huì)分泌樹脂以抵御其入侵，但如果云南切梢小蠹的群集足夠快速或者寄主本身長勢(shì)比較衰弱，寄主最終會(huì)由于其抵御機(jī)制耗盡而被入侵者殺死［11-12］。對(duì)于寄主的抵御反應(yīng)，云南切梢小蠹也有自己的防御機(jī)制，而且是通過調(diào)控自身防御相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)的。因此，對(duì)云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因進(jìn)行克隆分析有助于從分子水平闡釋云南切梢小蠹在受到寄主抵御時(shí)自身的防御機(jī)制。本研究利用RACE 技術(shù)，首次克隆了云南切梢小蠹Cu／Zn-SOD cDNA 全長序列并進(jìn)行初步分析，為探索在受到寄主抵御時(shí)云南切梢小蠹的自身防御機(jī)制提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

云南切梢小蠹采自云南省曲靖市沾益縣九龍山林場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取及RT-PCR

利用Trizol試劑（Invitrogen）提取云南切梢小蠹成蟲總RNA?？俁NA 經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析其質(zhì)量后，用分光光度計(jì)測(cè)定其含量。然后以提取的總RNA 為模板，用SMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒合成RACE cDNA模板。

1.2.2 SOD 基因克隆

從已構(gòu)建的云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得超氧化物歧化酶基因片段序列［13］，根據(jù)其設(shè)計(jì)3′RACE 引 物（5′-GTTGGCTTGTGCTGTTATTGGACT-3′）和5′RACE引物（5′-GTACCACCTGGTTGACTGCTTCTTGCAGTA-3′），以合成的cDNA為模板克隆獲得基因的3′和5′端序列。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3min；94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAquick-Gel Extraction Kit（Qiagen）回收PCR 產(chǎn)物，用TA 克隆法連接入pGEM?-T-easy載體（Promega），藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落進(jìn)行克隆，由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。然后將所得序列片段拼接得到cDNA 全長序列。

1.2.3 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）搜索開放閱讀框，GENETYX 軟件將其翻譯成氨基酸序列，并用Motifscan分析氨基酸序列中存在的結(jié)構(gòu)域。利用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ（neighborjoining）分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

解剖云南切梢小蠹成蟲分別獲得新鮮的頭、胸、腹、足、翅，用Trizol試劑提取獲得相應(yīng)部位的總RNA，并分別提取保存于-80 ℃冰箱的云南切梢小蠹幼蟲、蛹、成蟲的總RNA，然后將各樣本總RNA定量至1μg，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板。根據(jù)本次克隆獲得的云南切梢小蠹SOD 基因序列設(shè)計(jì)用于熒光定量的正向引物（5′-CTGACGGAGTAGCCACGAT-3′）和反向引物（5′-ATAACAGCACAAGCCAACC-3′）；根據(jù)華山松大小蠹和中歐山松大小蠹18SRNA 基因（GenBank 登錄號(hào)分別為KJ507200和KJ531053）的保守序列設(shè)計(jì)正向引物（5′-TTCAAATGTCTGCCTTATC-3′）和反向引物（5′-GTGGTAGCCGTTTCTCA-3′）擴(kuò)增獲得云南切梢小蠹18SRNA 基因片段，以作為內(nèi)參基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系（10μL）為：cDNA 模板1μL，上下游引物各0.5μL，iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix 5μL，雙蒸水3μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，55℃退火20s，然后讀板，39個(gè)循環(huán)；最后以每5s上升0.5 ℃的速度從65～95 ℃記錄熔解曲線，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄樣品重復(fù)3次。使用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，以18SRNA 為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT 法分析云南切梢小蠹各發(fā)育階段及不同部位SOD基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平［14］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

不同發(fā)育階段和不同部位的SOD 基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行One-way ANOVA 方差分析，多重比較采用Duncan法，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

經(jīng)過測(cè)序得到云南切梢小蠹SOD cDNA 序列全長為768bp，5′端非編碼區(qū)80bp，3′端非編碼區(qū)226bp，開放閱讀框462bp。將其在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為KM278528。該基因推導(dǎo)的多肽序列為153個(gè)氨基酸（圖1）。其推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)理論分子量為15.8ku，等電點(diǎn)為5.68。Motifscan分析顯示，該蛋白存在2個(gè)Cu／Zn-SOD 的特異序列（GFHIHEFGDNT42-52和GNAGGRLACAVI136-147），3個(gè)N-末端?；稽c(diǎn)（NGTV14-17、NGSL30-33、NMTD96-99），1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（casein kinaseⅡphosphorylation site）（TDEE73-76），4個(gè)N-端?；稽c(diǎn)（N-myristoylation site）（GSLKGL31-36、GCISAG54-59、GNIQAN83-88和GNAGGR136-141），2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（protein kinase C phosphorylation site）（SLK32-34和TDK98-100），第1～151氨基酸區(qū)域具有銅鋅超氧化物歧化酶超家族（copper／zinc superoxide dismutase superfamily）的保守結(jié)構(gòu)域。

圖2 云南切梢小蠹與其他昆蟲SOD多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of SOD sequences fromTomicus yunnanensis and other insects

2.2 氨基酸序列相似性比對(duì)及進(jìn)化樹分析

同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，云南切梢小蠹SOD 基因與中歐山松大小蠹（Dendroctonusponderosae）SOD基因在氨基酸水平上相似性高達(dá)93%，與赤擬谷盜（Triboliumcastaneum）也有71%的一致性。而與半翅目的點(diǎn)蜂緣蝽（Riptortuspedestris）、侵?jǐn)_錐獵蝽（Triatomainfestans），膜翅目的麗蠅蛹集金小蜂（Nasoniavitripennis）、佛羅里達(dá)弓背蟻（Camponotusfloridanus），鱗翅目的柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera），雙翅目的黑果蠅（Drosophilavirilis）、家蠅（Muscadomestica）氨基酸序列一致性也均在67%～71%之間。多序列比對(duì)分析表明，不同物種甚至不同目的昆蟲Cu／Zn-SOD 氨基酸序列存在多個(gè)高度保守區(qū)域。如圖2所示，Cu、Zn與6個(gè)組氨酸（His）殘基和1個(gè)天冬氨酸（Asp）配位，其中Cu原子分別與His44、His46、His61和His118配位，Zn原子分別與His61、His69、His78和Asp81配位。Cu、Zn共同連接His61組成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。半胱氨酸Cys55和Cys144之間形成了Cu／Zn-SOD中唯一一對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵。

為了確定克隆獲得的云南切梢小蠹SOD 與其他昆蟲SOD 的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA5.0將多序列比對(duì)所得結(jié)果用臨位相連法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，克隆獲得的云南切梢小蠹SOD明顯區(qū)別于Mn-SOD，與其他昆蟲的Cu／Zn-SOD聚為一族，并且與icCu／Zn-SOD 聚在一起。

圖3 云南切梢小蠹及其他物種SOD的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SODs fromTomicus yunnanensis and other insects

2.3 云南切梢小蠹SOD 基因在各發(fā)育階段及不同部位的表達(dá)

由圖4可以看出云南切梢小蠹SOD 基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá)，并且在蛹期相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于幼蟲期和成蟲期。圖5結(jié)果表明云南切梢小蠹SOD 基因在頭、胸、腹、足、翅各個(gè)部位均有表達(dá)。其中SOD 基因在足部表達(dá)量最高，顯著高于其他部位，在頭部也有較高表達(dá)，也明顯高于剩余3個(gè)部位。而在其胸部、腹部還有翅中的表達(dá)量相對(duì)都較低，并且在這3個(gè)部位中相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。

圖4 云南切梢小蠹不同發(fā)育階段SOD基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression levels of SOD gene in Tomicus yunnanensis at different developmental stages

圖5 云南切梢小蠹不同部位SOD基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative expression levels of SOD gene in different parts of Tomicus yunnanensis

3 討論

本研究利用RACE技術(shù)，克隆獲得了云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因。該基因與其他昆蟲SOD具有很高的相似性，這體現(xiàn)了不同昆蟲超氧化物歧化酶在進(jìn)化過程中的保守性。生物體內(nèi)Cu／Zn-SOD又可分為icCu／Zn-SOD和ecCu／Zn-SOD，兩者在催化歧化反應(yīng)時(shí)有著相同的速率和相似的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。ecCu／Zn-SOD在N 端存在一小段信號(hào)肽，為分泌型蛋白，主要存在于組織外基質(zhì)及細(xì)胞表面；icCu／Zn-SOD沒有信號(hào)肽，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中［15］。通過在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，本次所得云南切梢小蠹SOD 基因推導(dǎo)的氨基酸序列并無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，這些完全符合ic-Cu／Zn-SOD的結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步分析表明，克隆所得的云南切梢小蠹SOD與icCu／Zn-SOD聚在一起。因此斷定本研究得到的云南切梢小蠹SOD為icCu／Zn-SOD。

超氧化物歧化酶（SOD）被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，其廣泛存在于生物體各個(gè)發(fā)育階段及不同的組織，在很多不同類型的細(xì)胞中均有表達(dá)［8］。云南切梢小蠹icCu／Zn-SOD 基因在其各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，并且蛹期的表達(dá)量最高，與黃粉蟲icCu／Zn-SOD在蛹期表達(dá)量最高一致，不過在黃粉蟲幼蟲中隨著齡期的增加icCu／Zn-SOD 基因的表達(dá)量也增加，最終超過成蟲［16］。意大利蜜蜂和中華蜜蜂SOD 基因在蛹期表達(dá)量最低［17-18］，與本研究結(jié)果相反，這說明不同昆蟲在不同發(fā)育階段SOD 基因的相對(duì)表達(dá)量也不同，這可能與昆蟲自身的生活習(xí)性和環(huán)境有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)云南切梢小蠹ic-Cu／Zn-SOD 基因在足部的表達(dá)量顯著高于頭、胸、腹、翅各部位。目前對(duì)于昆蟲足部SOD 基因表達(dá)的相關(guān)研究較少，但已有研究表明蚌類不同組織中SOD表達(dá)強(qiáng)度雖然不同，卻在斧足組織中表達(dá)最強(qiáng)，這與斧足的運(yùn)動(dòng)功能是相關(guān)的［19］。紫貽貝主要依靠閉殼肌實(shí)現(xiàn)其貝殼的開閉，是其主要的運(yùn)動(dòng)器官，因此其閉殼肌SOD含量較豐富［20］。云南切梢小蠹平時(shí)基本以足部爬行運(yùn)動(dòng)為主，極少飛行，這可能與其足部SOD基因的表達(dá)量相對(duì)較高有很大關(guān)系。

超氧化物歧化酶不僅在細(xì)胞防御活性氧機(jī)制中扮演著重要角色，同時(shí)在昆蟲、脊椎動(dòng)物甚至一些水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物發(fā)揮先天免疫功能中也起著重要的作用［21-22］。它們能增強(qiáng)昆蟲對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)、熱壓、殺蟲劑還有一些微生物侵染的抵抗力［23］，在昆蟲生長發(fā)育和抗環(huán)境脅迫過程中起著巨大作用。在黃粉蟲中，SOD 在血細(xì)胞里表達(dá)量相對(duì)較高，而在角質(zhì)層和脂肪體中表達(dá)量相對(duì)較少，這可能是由于SOD參與免疫反應(yīng)，而血細(xì)胞正是昆蟲免疫系統(tǒng)的主要組成單元［16］。生命延續(xù)和抗逆性是生物體滯育期的兩個(gè)最重要特征，研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶在維持尖音庫蚊越冬期生命體征以及增強(qiáng)自身抗逆性中發(fā)揮著重要的作用［24］。現(xiàn)在對(duì)于超氧化物歧化酶在寄主與寄生物相互作用過程中所起的作用已經(jīng)有所研究。超氧化物歧化酶與由活性氧誘導(dǎo)的寄生蟲致死有關(guān)，另外，寄生蟲也能通過調(diào)控寄主的超氧化物歧化酶基因來滿足自己的生存［25］。

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