西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科(西安710004)

席俊峰△ 周 斌

MACC1基因干涉對食管癌細(xì)胞Eca109體外和體內(nèi)增殖的影響

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科(西安710004)

席俊峰△周 斌

目的：探討MACC1對食管癌細(xì)胞Eca109增殖的影響。方法：利用慢病毒載體介導(dǎo)的小發(fā)卡RNA(shRNA)干涉食管癌細(xì)胞Eca109中MACC1的表達(dá)。利用MTT法和平板克隆試驗(yàn)檢測MACC1對食管癌細(xì)胞增殖的影響，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化，最后利用裸鼠成瘤試驗(yàn)檢測MACC1對食管癌細(xì)胞體內(nèi)增值的影響。結(jié)果：成功建立MACC1干涉的食管癌細(xì)胞,MTT和平板克隆結(jié)果顯示MACC1基因干涉后抑制食管癌細(xì)胞的增殖,并使食管癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MACC1干涉后抑制食管癌細(xì)胞在體內(nèi)的增值。結(jié)論：干涉MACC1基因可抑制食管癌細(xì)胞的增殖。

MACC1是利用全基因組表達(dá)分析技術(shù)在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因[1]。研究結(jié)果顯示，MACC1在很多腫瘤組織中高表達(dá)，并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其在食管癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究擬利用慢病毒建立MACC1干涉的Eca109細(xì)胞系,初步探討MACC1基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖的影響。

材料與方法

1 材 料 人食管癌細(xì)胞系Eca109購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。293T細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科鐘代星博士提供。慢病毒干涉構(gòu)建質(zhì)粒pLKO.1-TRC control、pLKO.1- scramble shRNA、psPAX2、pMD2.G購自Addgene公司。兔抗人MACC1多克隆抗體購自abcam公司,小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自博士德公司。RT-PCR試劑盒及引物購自Takara公司。脂質(zhì)體2000和嘌呤霉素購自Invitrogen公司。

2 構(gòu)建MACC1干涉的Eca109穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 將兩個(gè)MACC1 shRNA(shMACC1-1：AAGATTGGACTTGTACACTGC,shMACC1-2: AAGCTTGGAAAAGGCTGGAGG)分別導(dǎo)入到pLKO.1載體中[2]。按照脂質(zhì)體2000說明將pLKO.1-shRNA、psPAX2、pMD2.G三種質(zhì)粒按照比例轉(zhuǎn)入到293T細(xì)胞內(nèi)。12h后移除轉(zhuǎn)染試劑，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h并收集病毒液，0.45 μm濾器過濾。將病毒液滴入食管癌細(xì)胞Eca109中(大約70%密度),培養(yǎng)48h加入嘌呤霉素(1mg/ml)。經(jīng)3周的篩選培養(yǎng),挑出單個(gè)克隆并擴(kuò)增,建立對照細(xì)胞系Eca109-SC和MACC1干涉的兩組細(xì)胞系Eca109-S1和Eca109-S2。

3 RT-PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)MACC1 mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書分別提取各組細(xì)胞總RNA。RT-PCR反應(yīng)按照試劑盒說明進(jìn)行操作。MACC1引物序列：5’-CCTTCGTGGTAATAATGCTTCC-3’ ，5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3’。GAPDH引物序列： 5’-GCCTCAAGATCATCAGCAAT -3’，5’- AGGTCCACCACTGACACGTT -3’。反應(yīng)條件為：94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30 s,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min，4℃保存。然后行agrose凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果,并照相。

4 Western-blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)MACC1 蛋白的表達(dá) 分別提取細(xì)胞的總蛋白。按照蛋白定量試劑盒說明書 BCA 法進(jìn)行總蛋白定量,取 50μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上,標(biāo)記預(yù)染marker的位置。50mg/L 脫脂牛奶封閉，一抗為1∶500 稀釋的抗MACC1 mAb,4℃,過夜,二抗室溫孵育1h,暗室內(nèi)加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑 ( ECL ),X光片顯影。

5 MTT檢測各組細(xì)胞的增值情況 取對數(shù)生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細(xì)胞分別加入到96孔板中,每孔約5×103細(xì)胞,培養(yǎng)基體積為200ml。每點(diǎn)設(shè)4個(gè)復(fù)孔,共鋪7塊96孔板。放置孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，隔兩天更換一次培養(yǎng)基。各組細(xì)胞接種后每24 h分別收集一次細(xì)胞樣品,收集7 d；在酶聯(lián)免疫儀上選擇490nm波長測定吸光值。最后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),繪制生長曲線。

6 平板克隆試驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成情況 取對數(shù)生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細(xì)胞分別接種于直徑為 6cm 的培養(yǎng)皿,每個(gè)皿接種的細(xì)胞數(shù)控制在200個(gè)左右,10ml 含每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。十字形晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分布。培養(yǎng)14d。以后每隔兩天更換培養(yǎng)基一次。培養(yǎng) 14d后,當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)中止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基。PBS洗滌3次,加入5 ml甲醇固定15 min。棄去固定液,加入 2ml 姬姆薩應(yīng)用液染色20min。用蒸餾水緩慢洗去姬姆薩染液,將培養(yǎng)皿放置于空氣中干燥后倒置；用肉眼直接計(jì)數(shù)紫色的細(xì)胞克隆數(shù)并拍照。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制直方圖。

7 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期的變化 取對數(shù)生長的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細(xì)胞，無血清DMEM 培養(yǎng)基24h，然后將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度80%～90%時(shí)收集細(xì)胞，做周期分析。細(xì)胞固定：胰酶將細(xì)胞消化下來后，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)，800rpm，5min。然后PBS洗兩次，70%乙醇1ml重懸細(xì)胞，充分吹勻，避免細(xì)胞形成團(tuán)塊。然后放置4℃冰箱過夜，離心棄去上清后用PBS洗滌細(xì)胞2次；用100 μl PBS重懸各組細(xì)胞，300 μl碘化丙啶染色液15 min。用FCM檢測。細(xì)胞周期分析采用美國Becton.Diekinson公司的CellQuit Plot分析軟件。

8 裸鼠成瘤試驗(yàn) 取對數(shù)生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細(xì)胞,常規(guī)消化細(xì)胞、離心并計(jì)數(shù)，取5×106個(gè)細(xì)胞,再次離心收集細(xì)胞沉淀。用0.2ml生理鹽水或者PBS重懸細(xì)胞,分別移至0.5ml的EP管內(nèi),封口膜封口。將裸鼠側(cè)腹部皮膚消毒。用1ml注射器吸取細(xì)胞懸液,將其注射到裸鼠皮下。每天觀察裸鼠一般狀況及腫瘤生長情況,記錄腫瘤生成的潛伏期,測量腫瘤的體積，接種細(xì)胞后第28 天,用頸椎脫臼法處死裸鼠,解剖取出瘤體。用微量天平稱重，按以下公式計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=長徑×短徑2/2,根據(jù)腫瘤體繪制腫瘤生長曲線。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0版本統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建MACC1干涉的Eca109穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 使用RT-PCR 方法檢測MACC1 mRNA在Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2細(xì)胞中MACC1 mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.01)(圖1A)。使用Western-blot方法檢測MACC1蛋白在Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2細(xì)胞中MACC1 蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.01)(圖1B)。

圖1 各組細(xì)胞中MACC1 mRNA 和蛋白的相對變化

2 MACC1基因干涉抑制Eca109細(xì)胞的增殖 以Eca109-SC細(xì)胞為對照，利用MTT法檢測Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細(xì)胞的增值情況并繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示，與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2兩組細(xì)胞生長明顯受到抑制，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Eca109-S1和Eca109-S2兩組細(xì)胞之間未見明顯差異(圖2A)。平板克隆結(jié)果顯示，經(jīng)過14天的培養(yǎng)，Eca109- SC組克隆數(shù)為：126±12，Eca109-S1和Eca109-S2兩組克隆數(shù)分別為：83±8和96±10，明顯少于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2 MACC1干涉對食管癌細(xì)胞Eca109增殖的影響

3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定細(xì)胞周期變化 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，與對照組Eca109-SC相比，Eca109-S1和Eca109-S2兩組細(xì)胞G0/G1周期細(xì)胞明顯增加(P<0.01)，而G2/M期和S期細(xì)胞周期分部無明顯差異。表明干涉MACC1后，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，從而抑制了細(xì)胞的增值(圖3)。

圖3 MACC1干涉對食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞周期的改變

4 MACC1基因干涉抑制Eca109細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力 種植Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三組細(xì)胞的裸鼠,在接種后7d左右均形成可見的腫瘤結(jié)節(jié),每3天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積變化，Eca109-SC組腫瘤生長迅速，而Eca109-S1和Eca109-S2兩組腫瘤相對較慢。接種四周后統(tǒng)一頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖出腫瘤，測量體積并稱重，結(jié)果顯示，Eca109-S1和Eca109-S2兩組腫瘤體積和重量明顯小于對照組腫瘤體積和重量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 MACC1干涉對食管癌細(xì)胞Eca109體內(nèi)成瘤的影響

討 論

2009年Ulrike等[1]通過全基因組表達(dá)分析技術(shù)分析結(jié)腸癌的癌灶轉(zhuǎn)移灶及正常結(jié)腸組織之間基因表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的基因-MACC1，發(fā)現(xiàn)MACC1是診斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)測結(jié)腸癌患者無病生存期的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)，并且證明MACC1通過HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值、浸潤和轉(zhuǎn)移。MACC1基因定位于人類7號染色體(7p21.1),由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,其cDNA序列中含2559個(gè)核苷酸序列。MACC1基因編碼由852個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其主要結(jié)構(gòu)包括：SH3結(jié)構(gòu)域、ZU5結(jié)構(gòu)域、DD1區(qū)和DD2區(qū)結(jié)構(gòu)片段[3]。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究表明,MACC1在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)增高,比如：胃癌、肝癌[4]、肺癌[5]和卵巢癌[6]等,并且能夠很好地預(yù)測患者的預(yù)后。在胰腺癌患者的血清中,與健康人相比,MACC1的蛋白水平明顯升高,并MACC1的蛋白水平與腫瘤的TNM分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞中干涉MACC1的表達(dá)后,可明顯抑制細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移以及EMT,而且MACC1可作為吉西他濱治療胰腺癌效果的預(yù)測分子,提示MACC1可能有助于胰腺癌的個(gè)體化治療[7]。王建軍等[8]報(bào)道MACC1蛋白在食管癌組織

中的表達(dá)水平高于癌旁組織，MACC1蛋白的表達(dá)水平與食管癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度顯著相關(guān)，提示MACC1的異常表達(dá)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體成功構(gòu)建MACC1基因干涉的Eca109穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為深入研究MACC1基因在食管癌的作用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。MTT試驗(yàn)和平板克隆試驗(yàn)結(jié)果顯示食管癌細(xì)胞Eca109中MACC1基因干涉后，其生長速度以及克隆數(shù)明顯下降，提示干涉MACC1基因可抑制食管癌細(xì)胞Eca109的增殖能力。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示MACC1通過使食管癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，從而抑制細(xì)胞的增殖。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：干涉MACC1基因可抑制食管癌細(xì)胞Eca109在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。綜合上述研究，提示MACC1有可能成為食管癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。其分子機(jī)制還需要我們進(jìn)一步研究。

[1] Stein U.MACC1, a newly identified key regulator of HGF-MET signaling, predicts colon cancer metastasis[J].Nat Med, 2009,15(1)：59-67.

[2] Xu CS.MSP58 knockdown inhibits the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma in vitro and in vivo[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012,13(7)：3233-3238.

[3] 蔡新生 ,閆朝光,王廣春,等.MACC1基因在胃癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 醫(yī)藥前沿, 2012(24)：209.

[4] 劉清泉,劉青光,昝獻(xiàn)峰,等.MACC1基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版， 2010,39(1)：22-24,28.

[5] Shimokawa H.Overexpression of MACC1 mRNA in lung adenocarcinoma is associated with postoperative recurrence[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2011,141(4)：895-898.

[6] Zhang R.Effects of metastasis-associated in colon cancer 1 inhibition by small hairpin RNA on ovarian carcinoma OVCAR-3 cells[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2011,30：83.

[7] Wang G.MACC1：A potential molecule associated with pancreatic cancer metastasis and chemoresistance[J]. Oncol Lett, 2012, 4(4),783-791.

[8] 王建軍,洪 強(qiáng),胡叢崗,等.結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1蛋白在食管癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013, 93(32)：2584-2586.

(收稿：2014-03-10)

△陜西省榆林市第一醫(yī)院

食管腫瘤 基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤 細(xì)胞增殖 @MACC1基因

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.005