陜西中醫(yī)學(xué)院免疫及檢驗學(xué)教研室(咸陽712046)

施京紅 王 萍 胥 冰 張麗君 丁 輝△

·論著·基礎(chǔ)研究·

吳茱萸堿對大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白表達(dá)的影響*

陜西中醫(yī)學(xué)院免疫及檢驗學(xué)教研室(咸陽712046)

施京紅 王 萍 胥 冰 張麗君 丁 輝△

目的：研究吳茱萸堿(Evo)對大鼠下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達(dá)水平的影響。方法：選用雄性5周齡Sprague-Dawly大鼠36只，分為對照組、Evo 4mg/kg組、40 mg/kg組。Evo灌胃25d后取材；采用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡的方法，觀察Evo對下丘腦弓狀核中NPY免疫陽性產(chǎn)物的表達(dá)和NPY蛋白水平的影響。結(jié)果：吳茱萸堿40 mg/kg干預(yù)后，下丘腦弓狀核NPY-IR陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，同時NPY蛋白表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論：Evo可顯著降低大鼠下丘腦弓狀核促食欲肽NPY蛋白水平，提示下丘腦可能是Evo調(diào)節(jié)攝食行為的重要中樞。

吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實中提取的一種主要生物堿成分，具有多種藥理學(xué)效應(yīng)，如降低體重、調(diào)節(jié)體溫、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛及對心血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用[1-4]。下丘腦及其回路在調(diào)制與攝食有關(guān)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)信號中起著重要作用，是調(diào)節(jié)攝食和能量代謝的主要中樞。弓狀核(The arcuate nucleus，ARC)是下丘腦中調(diào)控攝食與體重的重要核團(tuán)，包含促進(jìn)攝食反應(yīng)和誘導(dǎo)厭食反應(yīng)的神經(jīng)元功能區(qū)。NPY釋放的階段性升高和降低與食欲的啟動與終止有關(guān)。我們前期研究表明，Evo能降低下丘腦促食欲肽NPY mRNA的表達(dá)，但是，Evo是否影響下丘腦ARC中NPY蛋白水平的表達(dá)尚不清楚。我們推測下丘腦可能是Evo發(fā)揮降低體重作用的主要中樞位點。本研究采用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry)和蛋白免疫印跡(Western Blotting)的方法，觀察Evo對下丘腦弓狀核中NPY免疫陽性產(chǎn)物的表達(dá)和NPY蛋白水平的影響。

材料與方法

1 試 劑 Evo購自陜西匯生醫(yī)藥科技有限公司，純度99.24%，用雙蒸水配制成混懸液。①免疫組化實驗試劑：10%小牛血清，武漢博士德生物公司；兔抗大鼠NPY多克隆抗體(bs-0071R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(HRP)，武漢博士德生物技術(shù)公司；②Western Blotting實驗試劑：兔抗大鼠NPY多克隆抗體，Chemicon，AB9608，USA；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體，武漢博士德生物技術(shù)公司；山羊抗兔IgG(H&L)二抗(HRP)，武漢博士德生物技術(shù)公司；山羊抗小鼠IgG(H&L)二抗(HRP)，武漢博士德生物技術(shù)公司。

2 實驗方法

2. 1 動物及實驗操作：選用雄性5周齡Sprague-Dawly大鼠36只，初始體重60～80g。動物房溫度20～22°C，光暗周期為12∶12 h(8：00-20：00)，自由飲食。大鼠被隨機(jī)分為三組：每組12只。適應(yīng)實驗室條件及實驗操作1周后，于上午10：00灌胃。大、小劑量組分別以Evo 40 mg/kg、4 mg/kg劑量灌胃，對照組灌以雙蒸水。按1 ml/100g溶液體積根據(jù)大鼠體重灌胃，速度為1 ml/5 s，1次/d，共灌胃25 d。動物處死取材在上午10:00-12:00進(jìn)行。大鼠進(jìn)行完前述實驗后，在烏拉坦麻醉下(1.2 g/kg, 腹腔注射)取材。

2.1.1 NPY的免疫組織化學(xué)染色：開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈，先以0.0l mol/L PBS(pH 7.4)100 ml快速灌注沖去血液，繼之以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH 7.4)灌注固定液250 ml快速灌注固定，然后再以同樣的灌注固定液250 ml緩慢滴注，持續(xù)l .5～2 h。灌注完畢后開顱取腦組織，并將所取的腦組織置于上述新鮮固定液中后固定4 h(4℃)，然后將腦組織移入含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中(4℃)過夜。待腦組織在蔗糖中完全沉底后，石蠟包埋。

2.1.2 Western Blotting檢測：開顱骨取腦，在冰生理鹽水中沖洗并在解剖顯微鏡下切取雙測下丘腦ARC，迅速投入液氮中。將所取組織凍存于-80℃冰箱，以備檢測。

2.2 NPY的免疫組織化學(xué)染色：取各組大鼠腦組織在石蠟切片機(jī)上冠狀切取下丘腦含弓狀核腦區(qū)，片厚7 μm，按照切片順序隔2張取1張，切片分三組收集于含0.01 mol/L PBS(pH 7.4)的碟子中備用，每組通常包含16～18張腦組織切片。取第一套切片，按SP法免疫組化檢測試劑盒的使用流程進(jìn)行NPY的免疫組織化學(xué)染色。取第二套切片進(jìn)行Nissl染色。以便對照觀察免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記的神經(jīng)元的位置。取第三套組腦組織切片，省略或用正常兔血清替代兔抗大鼠NPY抗體，后續(xù)步驟同前，進(jìn)行對照實驗，沒有陽性結(jié)果被檢測。圖像信號采集分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行觀察，NPY陽性表達(dá)呈棕黃色，正常胞核蘇木素復(fù)染后呈藍(lán)色(圖1)。為了防止計數(shù)的假陽性及重復(fù)計數(shù)，只有那些具有足夠亮度且能觀察到胞體的神經(jīng)元才被記錄。而不能清楚分辨的神經(jīng)元則一律舍棄不計。因此，NPY免疫陽性標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)僅代表最少數(shù)量的免疫陽性神經(jīng)元。

2.3 Western Blotting檢測：取出待測組織，每個樣品取20 mg左右，按20 mg/ml比例加入RIPA蛋白裂解液，同時添加Proteinase inhibitor cocktail(終濃度為40 μl/ml)和STI(終濃度為0.1 mg/ml)，得到組織樣本的總蛋白，儲存于-80℃?zhèn)溆茫蛴糜诤康臏y定。使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每泳道加樣量均為30 μg，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，二抗孵育后，ECL發(fā)光并且X膠片曝光。全自動凝膠成像系統(tǒng)對X膠片進(jìn)行掃描分析并拍照，蛋白相對表達(dá)量用光密度表示，以GAPDH一抗作為參照來糾正加樣誤差。

結(jié) 果

1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在研究的三組動物中，均可在下丘腦弓狀核內(nèi)觀察到呈現(xiàn)棕黃色的NPY免疫陽性的產(chǎn)物分布，主要在神經(jīng)元胞漿中，并且該免疫陽性的神經(jīng)元主要呈圓形，部分為不規(guī)則形狀，直徑大約15～20 μm(圖1)。Evo 40 mg/kg干預(yù)后，下丘腦弓狀核NPY陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比顯著減少(P= 0.001)，Evo 4 mg/kg干預(yù)后，陽性細(xì)胞數(shù)與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05)(圖2)。

圖1 免疫組化染色結(jié)果顯示不同處理組下丘腦弓狀核內(nèi)NPY免疫陽性的表達(dá)(NPY免疫陽性的產(chǎn)物分布在ARC內(nèi)的神經(jīng)元的胞漿，呈棕黃色，多數(shù)為圓形，部分為不規(guī)則形。其中，A為下丘腦ARC的Nissl染色圖；B、C和D分別為對照組、Evo 4 mg/kg干預(yù)組和Evo 40 mg/kg干預(yù)組ARC內(nèi)的NPY免疫組化染色的高倍放大圖。標(biāo)尺：A = 400μm，B、C、D = 50 μm)

2 Western Blotting結(jié)果 應(yīng)用Western Blotting方法檢測了下丘腦弓狀核促攝食肽NPY的表達(dá)(圖3)。Evo 40 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比顯著降低(P< 0.05)；Evo 4 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比無顯著變化(P> 0.05)(圖4)。

圖2 Evo 40 mg/kg干預(yù)大鼠后，下丘腦弓狀核NPY陽性細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組(***P=0.001)；Evo4mg/kg干預(yù)后陽性細(xì)胞數(shù)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)

圖3 各組NPY免疫印跡條帶[1：對照組；2：Evo 4 mg/kg處理組；3：Evo 40 mg/kg處理組。用藥組隨著用藥量的增大，NPY的表達(dá)量逐漸降低。NPY Mol wt: 8 kDa(NPY抗體是以Ncbi 數(shù)據(jù)庫中NPY-97個氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計的，包含前信號肽，抗原結(jié)合位點是：P-G-D-E-A-P-A-E-D-M-A-R-Y)，內(nèi)參GAPDH：36 kDa]

圖4 Evo對下丘腦ARC中NPY蛋白水平的影響 (Evo 40 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Evo 4 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義)

討 論

我們的研究顯示，Evo 40 mg/kg灌胃，大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白水平表達(dá)與對照組相比顯著降低。前期研究結(jié)果[5-6]顯示,Evo干預(yù)后大鼠攝食量及體重顯著下降，血清Leptin水平增高，顯著抑制下丘腦NPY mRNA的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為Evo抑制NPY蛋白水平的表達(dá)在抑制攝食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo調(diào)控攝食、體重的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

實驗證明，ARC-PVN軸NPY釋放增加與攝食行為的啟動有關(guān)，禁食時NPY增加。應(yīng)用藥理學(xué)、生理學(xué)或基因干預(yù)的方法，實驗性降低NPY與其受體Y1、Y5的作用可以抑制食欲，說明NPY是大腦的自然食欲發(fā)生器[7-9]。EVO通過散熱和產(chǎn)熱分散食物熱量，增加能量消耗，抑制內(nèi)臟周圍脂肪和體重增加[10]。NPY是生理性食欲啟動子，下丘腦NPY釋放的異常，可產(chǎn)生過食、能量消耗的降低及一系列新陳代謝性疾病。因此，針對ARC-PVN神經(jīng)軸，研究有效調(diào)控NPY的藥物，避免或減緩這些疾病的發(fā)生和發(fā)展是臨床迫在眉睫的課題。

轉(zhuǎn)基因肥胖模型中，NPY不適當(dāng)和無限制地過度表達(dá)引起肥胖，這是由于Leptin對這些神經(jīng)元的正常抑制作用缺失所導(dǎo)致，包括：①ob/ob小鼠：無生物功能Leptin；②db/db小鼠和fa/fa fatty Zucker大鼠：Leptin受體突變[11-12]。在這些模型中，NPY mRNA表達(dá)增加伴隨NPY蛋白水平在ARC、PVN、DMH核團(tuán)中增高，結(jié)果與禁食和IDDM模型表現(xiàn)一致[13]。

在本研究中，Evo 40 mg/kg顯著下調(diào)大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白水平的表達(dá)，而我們的前期結(jié)果顯示Evo明顯升高血清Leptin水平，顯著抑制下丘腦NPY mRNA的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為Evo抑制NPY蛋白水平的表達(dá)在抑制攝食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo調(diào)控攝食、體重的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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(收稿：2014-11-07)

Influence of evodiamine on the expresstion of peptide NPY in hypothalamic ARC in rats

Department of Medical Techniques, Immunology and Science of Inspection Teaching and Research Section,Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Shi Jinghong Wang Ping Xu Bin et al

Objective: To investigate the effect of evodiamine (Evo) on the expresstion of peptide NPY in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus in rats. Methods: Male Sprague-Dawley rats (5 weeks old,n=36) were randomly divided into three groups (n=12). Intragastric administration of Evo 40 mg/kg, Evo 4 mg/kg or water was infused for 25 days, once a day. We evaluated the effect of Evo on NPY peptide expression. NPY was detected by immunohistochemistry in cytoplasm of the hypothalamic ARC. The expression of peptide NPY in hypothalamic ARC was measured by Western Blotting. Results: The frequency of NPY-IR neurons of Evo 40 mg/kg was significantly smaller than control group. The expression of orexigenic peptide NPY in hypothalamic ARC of the animals treated with Evo 40 mg/kg (Ratio of light density between NPY and GAPDH) had a noticeable drop compared with the control group. Conclusion: Our results show that intragastric administration of Evo (40 mg/kg) decreased orexigenic NPY peptide level in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus. This is one of the most important mechanisms of Evo in the hypothalamus.

Evodiamine/pharmacology NeuropeptideY Arcuate nucleus Hypothalamus Immunohistochemistry Rats

* 陜西省教育廳課題(2010JK489)

吳茱萸堿/藥理學(xué) 神經(jīng)肽Y 弓狀核 下丘腦 免疫組織化學(xué) 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.001

△ 陜西省中醫(yī)醫(yī)院