李秀榮 齊元富 李慧杰

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟南，250014)

芪連扶正膠囊對TGF-β介導(dǎo)EMT作用的影響

李秀榮 齊元富 李慧杰

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟南，250014)

目的：觀察芪連扶正膠囊含藥血清對TGF-β及EMT相關(guān)分子在肺癌A549細胞中表達的影響，探討相關(guān)機制。方法：體外培養(yǎng)肺癌A549細胞，制備芪連扶正膠囊含藥血清，分組干預(yù)，采用RT-PCR檢測TGF-β1mRNA表達，IC檢測E-cad與N-cad表達。結(jié)果：對照組、芪連扶正低劑量、中劑量、高劑量組、化療組及聯(lián)合組的TGF-β1 mRNA相對表達量依次為(31.11±1.58)%、(29.53±1.50)%、(27.28±1.75)%、(25.23±1.38)%、(23.03±1.59)%、(20.72±1.38)%；各組E-cad、N-cad均有不同程度陽性表達，除芪連扶正膠囊低劑量組外，各藥組E-cad陽性率均高于對照組、N-cad則相反(P<0.05或P<0.01)；與化療組相比，聯(lián)合組及芪連扶正膠囊各組亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：芪連扶正膠囊可通過逆轉(zhuǎn)TGF-β介導(dǎo)的EMT作用防止腫瘤轉(zhuǎn)移。

芪連扶正膠囊；TGF-β；EMT；抗腫瘤轉(zhuǎn)移

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，EMT是上皮細胞獲得遷移能力的有效方式，也是上皮細胞癌浸潤轉(zhuǎn)移的一個重要途徑[1]。TGF-β在體內(nèi)和體外培養(yǎng)的大多數(shù)上皮細胞、上皮來源的腫瘤細胞中均具有誘導(dǎo)EMT的作用，是目前研究最廣泛的EMT誘導(dǎo)因子[2]。大量實驗與臨床研究證實中醫(yī)藥具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用，筆者選用具有解毒化痰、消積散結(jié)、扶正抗癌之效的院內(nèi)制劑芪連扶正膠囊為研究對象，觀察其對TGF-β及EMT相關(guān)分子在肺癌A549細胞中表達的影響，以期為防治肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移篩選有效中成藥。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物 高轉(zhuǎn)移人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞株，購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞室。SPF級SD雄性大鼠，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，質(zhì)量合格證編號為SCXK(魯)20110003。

1.2 藥品試劑 芪連扶正膠囊(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，批號：Z0120030239)，順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司，批號：207062DC)。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，兔抗人E-cad多克隆抗體(編號：BA0475)、兔抗人N-cad多克隆抗體(編號：BA0673)、濃縮型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，總RNA提取試劑盒、SuperRT二步法RT-PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。TGF-β1與β-actin引物：由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，TGF-β1上游5’-CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3’，下游5’-GTCACCAGAGAAAGAGGAC-3’，分子量：384bp；β-actin上游5’-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’，下游5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，分子量：302 bp。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(美國Thermo Forma公司)，CO2培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱、超純水系統(tǒng)(德國Heraeus公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，電熱壓力蒸汽消毒器(山東安得醫(yī)療科技有限公司)，梯度PCR儀、電泳儀(德國Biometro公司)，PCR儀(英國Thermo Hybaid公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Alpha公司)。

1.4 芪連扶正膠囊含藥血清制備 購買體200 g左右、♂SD大鼠25只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d；分為芪連扶正膠囊組與空白對照組，前者予以芪連扶正膠囊溶液灌胃，后者給予等量生理鹽水，1次/d；給藥第7 d末次灌藥前12 h禁食，末次給藥后1 h戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，離心，取上清，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實驗分組 共分6組：對照組(10%胎牛血清)，芪連扶正膠囊低劑量組(5%含藥血清)，芪連扶正膠囊中劑量組(10%含藥血清)，芪連扶正膠囊高劑量組(20%含藥血清)，順鉑組(終濃度為2 μg/mL)，聯(lián)合組(10%含藥血清+順鉑)。

1.6 PT-PCR檢測TGF-β1 mRNA表達 常規(guī)培養(yǎng)細胞，制備細胞懸液，平均分瓶，待細胞長滿時按實驗分組加藥干預(yù)，48 h時后按試劑盒說明書逐步提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA樣品純度，各組樣品吸光度比值均在1.93～1.96之間，可進行后續(xù)實驗。按試劑盒說明書逐步合成cDNA、擴增PCR，制膠、上樣，跑電泳約30 min，完畢后將膠板至0.5 μg/mL EB溶液中室溫染色20 min，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察拍照，分析各目的條帶和內(nèi)參的灰度值(IDV)，計算相對表達量(RATIO)，RATIO=目的條帶IDV/內(nèi)參IDV[3]。

1.7 IC檢測E-cad與N-cad表達 常規(guī)培養(yǎng)細胞，制備細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整密度以2×105為宜；將細胞懸液垂直加于到經(jīng)預(yù)處理有蓋玻片的六孔板內(nèi)，2 mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)；待細胞爬好片后，按實驗分組加藥，48 h后棄液，95%乙醇固定，5%Trion X-100室溫孵育，3%H2O2室溫孵育，正常山羊封閉血清封閉，一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，二抗稀釋液37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min，DAB顯色5～30 min，以均勻黃染為宜，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇脫色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中心樹膠封片，觀察拍照，高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)單因素方差分析，檢驗標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA表達 對照組、芪連扶正低劑量、中劑量、高劑量組、化療組及聯(lián)合組的TGF-β1 mRNA相對表達量依次為(31.11±1.58)%、(29.53±1.50)%、(27.28±1.75)%、(25.23±1.38)%、(23.03±1.59)%、(20.72±1.38)%；與對照組相比，各藥組TGF-β1mRNA的相對表達量均低于對照組，但芪連扶正膠囊低劑量組與之無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，余藥組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與化療組相比，芪連扶正膠囊各組TGF-β1mRNA的相對表達量均高于化療組，比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，而聯(lián)合組TGF-β1mRNA的相對表達量低于化療組，比較亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化檢測E-cad與N-cad表達 胞漿、胞核、胞膜為棕黃色顆粒者即陽性細胞，各組E-cad與N-cad均有不同程度陽性表達。與對照組相比，各藥組E-cad陽性率均高于對照組、N-cad則相反，其中芪連扶正膠囊低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，余藥組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與化療組相比，芪連扶正膠囊各組E-cad陽性率均低于化療組、N-cad高于化療組，比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而聯(lián)合組E-cad高于化療組、N-cad低于化療組，比較亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；見表1。

表1 EMT相關(guān)因子蛋白表達情況

注：單因素方差分析，與化療組比較,*P<0.05，**P<0.01；與對照組比較,△P<0.05、△△P<0.01。

3 討論

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，存在于多種慢性疾病的發(fā)病過程及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中。E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)的減少或丟失、分子Zonula occludens-1(ZO-1)的丟失和重定位、上調(diào)某些蛋白質(zhì)的表達以及EMT與胞外基質(zhì)的關(guān)系是EMT的主要特征[4]。在EMT過程中伴有多個細胞分子標(biāo)志改變，其中E-cadherin的減少或丟失是EMT最重要的標(biāo)志性變化，同時也是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要表現(xiàn)，另一種鈣黏蛋白，N-鈣黏蛋白(N-cadherin)在EMT發(fā)生后表達增加，具有促進腫瘤細胞運動和轉(zhuǎn)移的作用[5]。EMT可被多種信號分子所誘導(dǎo)，其中TGF-β是其誘導(dǎo)發(fā)生的關(guān)鍵因子，研究較為廣泛。TGF-β參與腫瘤EMT過程的主要機制是通過Smad途徑和非Smad途徑完成的[6-7]。首先，TGF-β與腫瘤細胞膜上的TβRⅡ結(jié)合，通過TβRⅡ激酶使TβRⅠ磷酸化，進一步激活下游的Smad2/3，磷酸化的Smad2/3再與胞內(nèi)的Smad4結(jié)合形成三聚體，進入細胞核與DNA結(jié)合而發(fā)生相互作用，促使EMT形成[8]。TGF-β還可通過非Smad依賴途徑對腫瘤EMT進行調(diào)節(jié)，如絲裂原活化的蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)途徑，TGF-β通過MAPK途徑激活下游的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinase,ERK)，從而誘導(dǎo)腫瘤EMT發(fā)生[9]。TGF-β/Smad通路與多條通路間進行“交談”，與Wnt通路的“對話”可上調(diào)EMT誘導(dǎo)因子Snail和Twist，抑制E-cad表達，同時激活β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物，間接導(dǎo)致vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達，共同協(xié)調(diào)完成對腫瘤EMT的調(diào)節(jié)[10]。鑒于EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，其相關(guān)研究可深入了解EMT影響腫瘤的機制，還可促進EMT作為生物標(biāo)記物與靶點治療的研究[11]。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤防治中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)一些中藥的有效成分及復(fù)方有明顯的抗腫瘤作用，具有良好的應(yīng)用前景，而其中中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌進展較快，尤其體現(xiàn)在中藥對肺癌放化療減毒和增效及手術(shù)后防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面的研究方面[12]。芪連扶正膠囊由生黃芪、連翹、莪術(shù)、清半夏、天南星、白花蛇舌草、仙鶴草、全蝎、蜈蚣、壁虎、女貞子十一味中藥組成，方中黃芪乃補氣藥之長，可補中益氣，營運中州，且生用力專，取其益氣托毒之功；連翹不僅能解瘡毒，又能散氣血凝聚、具有消癰散結(jié)之功，為瘡家圣藥；莪術(shù)有破血行氣，消積止痛之效，為醫(yī)家治積聚最藥；清半夏、天南星、白花蛇舌草、仙鶴草、全蝎、蜈蚣、壁虎多具有解毒祛瘀散結(jié)之效；女貞子則補益肝腎、滋陰清熱，反佐諸藥傷陰之弊。芪連扶正膠囊縱觀全方，藥精力專，可針對腫瘤患者病機特點發(fā)揮解毒消積、扶正抗癌作用。且大量現(xiàn)代藥理研究證實本膠囊所選藥物可通過不同機制、不同程度的抑制腫瘤細胞、調(diào)節(jié)機體免疫力達到抗腫瘤作用，印證了芪連扶正膠囊組方的合理性與治療惡性腫瘤的有效性[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EMT是肺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因，TGF-β可以促使肺癌細胞中E-cad表達減少，細胞發(fā)生EMT，提高其侵襲和遷移能力[14]。本研究結(jié)果表明芪連扶正膠囊含藥血清可上調(diào)E-cad表達、下調(diào)N-cad表達與TGF-β1mRNA表達，逆轉(zhuǎn)TGF-β介導(dǎo)的EMT發(fā)生，發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，提示芪連扶正膠囊可作為防治肺癌轉(zhuǎn)移的有效中成藥。

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(2013-08-30收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

Effect of Qilian Fuzheng Capsule on TGF-β-mediated EMT

Li Xiurong, Qi Yuanfu, Li Huijie

(TheAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTCM,Jinan250014，China)

Objective:To observe the effect of Qilian Fuzheng Capsule on expression of EMT(epithelial mesenchymal transition) and TGF-β in lung cancer A549 cells, and study its possible mechanism.Methods:A549 cells were cultured in vitro and group intervened, RT-PCR to detected the expression of TGF-β1mRNA, using Immunohistochemical to detected the expression of E-cad and N-cad.Results:the TGF-β1 mRNA relative expression of the control group，Qilian Fuzheng Capsule low, medium and high dose groups, chemotherapy group and combined group were (31.11±1.58)%、(29.53±1.50)%、(27.28±1.75)%、(25.23±1.38)%、(23.03±1.59)%、(20.72±1.38)% respectively. Except the low-dose group, the expression of E-cad and N-cad in other drug groups were all significantly different compared with the control group; the combined group and all Qilian Fuzheng Capsule groups were significantly different compared with the chemotherapy group.Conclusion:Qilian Fuzheng Capsule can reverse the TGF-β-mediated EMT therefore play an anti-tumor effect.

Qilian Fuzheng Capsule; TGF-β; EMT; Anti-metastatic

李秀榮(1963—)，女，漢族，山東濟南人，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治研究

R285.6;R243

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.022