白雪秋 龐震國 張偉杰 常亞青 高銀雪 丁 君

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連 116023)

中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)主要分布于日本的北海道和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的海域(常亞青等, 2004), 具有生長快和性腺品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn), 1989年由大連海洋大學(xué)從日本引入我國, 目前已成為我國最具有經(jīng)濟(jì)價值的海膽種類之一(Dinget al,2007)。溫度是影響海洋動物生長和生理活動的重要因子(Burgeet al, 2014),溫度直接影響中間球海膽的生長發(fā)育、攝食代謝、繁殖存活、性腺產(chǎn)量和品質(zhì)等(常亞青等, 1999; 馬福恒, 2002)。中間球海膽在原產(chǎn)地的生存水溫為–2—25°C, 在 15°C左右攝食最為活躍, 超過 23°C即可導(dǎo)致生長減慢、疾病暴發(fā)甚至大量死亡(常亞青等, 2004)。熱休克蛋白(Heat Shock Protein)是一種高度保守的蛋白質(zhì), 其主要的功能是作為分子伴侶, 防止蛋白折疊、重新折疊變性蛋白及將變性蛋白降解等。根據(jù)分子量不同, 熱休克蛋白可分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子量的HSP蛋白。HSP70蛋白和HSP90蛋白是熱休克蛋白家族中的重要成員, 通過在應(yīng)激反應(yīng)中快速調(diào)節(jié)細(xì)胞的防御體系使細(xì)胞得到修復(fù)和保護(hù), 對可能造成蛋白質(zhì)損傷的環(huán)境因素產(chǎn)生誘導(dǎo)性表達(dá), 可以用來分析生物對環(huán)境變化的響應(yīng)(董云偉等, 2008; 于姍姍等, 2012)。HSPs蛋白家族成員在凋亡體形成的不同階段發(fā)揮阻斷作用, HSP70蛋白作為分子伴侶可以通過阻斷細(xì)胞色素c的釋放、阻斷 Apaf-1寡聚化及阻斷 casepase-9的活化等多種方式阻斷凋亡體的形成,因而認(rèn)為hsp70基因(簡稱hsp70)的表達(dá)能保護(hù)細(xì)胞免受熱激引起凋亡(Mosseret al, 2000; Salehet al,2000);hsp90基因(簡稱hsp90)則通過阻斷Apaf-1寡聚化, 參與阻斷凋亡體的形成(Yahara, 1998)。溫度變化可誘導(dǎo)海膽(Paracentrotus lividus)(Matrangaet al,2000)和海參(Apostichopus japonicus)(Donget al,2007)hsps的表達(dá)。Matranga等(2002)用hsp70作為脅迫標(biāo)記通過海膽體腔細(xì)胞來分析海膽對溫度脅迫、酸性pH和重金屬的響應(yīng)。Dong等(2007)發(fā)現(xiàn)高溫脅迫幼參影響hsp70的表達(dá)量。吉成龍等(2011)報道在28°C的熱激條件下刺參體壁中hsp70的表達(dá)量增加。Zhao等(2014)通過加入捕食者來研究海膽的遮蔽行為中hsp70的表達(dá)量差異。Osovitz等(2005)研究了環(huán)境溫度對紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)管足組織hsp70基因表達(dá)的影響。本研究對中間球海膽在高溫脅迫條件下hsp70和hsp90基因的表達(dá)差異進(jìn)行初步研究, 在分子水平上探究海膽的耐熱性能,闡釋海膽中熱休克蛋白對高溫誘導(dǎo)的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需中間球海膽均取自農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.1 海膽不同組織樣品 從健康海膽隨機(jī)選取40 枚[殼徑為(43.09±0.53)mm, 體重為(32.15±0.36)g],用于海膽的不同組織中hsp70、hsp90基因的表達(dá)研究。

1.1.2 海膽不同家系樣品 從11月齡的海膽耐熱品系中隨機(jī)選取 3個家系(2013Si1-1, 2013Si7-2,2013Si13-2), 并與3個對照家系(2013SiC-3, 2013SiC-5,2013SiC-6)共同用于研究hsp70、hsp90基因在海膽不同家系中的表達(dá), 每個家系隨機(jī)選取40枚海膽[殼徑為(16.32±0.63)mm, 體重為(2.02±0.20)g], 共 240枚。

1.2 溫度處理

將實(shí)驗(yàn)海膽置于同一個升溫水槽內(nèi)進(jìn)行升溫實(shí)驗(yàn)。初始溫度為19°C(0h), 溫度以每0.5h升高2°C, 升至29°C, 然后維持至6h后讓水溫自然回落。分別在實(shí)驗(yàn)開始0h、1.5h、3h、6h、12h、24h、48h的時間點(diǎn)取樣(常亞青等, 1999; 馬福恒, 2002)。

1.3 樣品采集

用于不同組織實(shí)驗(yàn)海膽的取樣組織部位為海膽管足、體腔細(xì)胞(離心體腔液得到)、口器、性腺和腸,將樣品收集于1.5mL RNase離心管中, 經(jīng)液氮冷凍后,存于–80°C冰箱保存。

海膽耐熱家系和對照家系的取樣部位為海膽管足, 將海膽管足樣品存于1.5mL RNase離心管后迅速用液氮冷凍, 于–80°C冰箱保存。

其中每個海膽單獨(dú)采集樣品, 然后將每5個生物學(xué)重復(fù)的樣品等量混合后進(jìn)行 RNA提取, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 總RNA的提取及cDNA的制備

將凍存的組織取出 10—20mg, 提取總 RNA(RNA提取試劑盒, 天根生化科技有限公司, 北京)。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性, NV3000 sepctrophotometer檢測 RNA純度及濃度, 將符合實(shí)驗(yàn)要求的RNA溶液凍存于–80°C冰箱中備用。

PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa, 中國大連)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20μL反應(yīng)體系包含 4μL 5×PrimeScriptTMbuffer, 1μL PrimeScriptTMRT enzyme Mix I, 25pmol Oligo dT Primer, 50pmol Random 6 mers, 500ng Total RNA, RNase Free ddH2O補(bǔ)足至20μL。樣品混勻后在 PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 條件為37°C 15min, 85°C 5s。

1.5 引物設(shè)計(jì)篩選及RT-PCR

采用primer premier5.0(韓俊英等, 2011)軟件對每個基因設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量 PCR引物, 檢測其引物特異性及擴(kuò)增效率, 經(jīng)過篩選每個基因各得到一對特異性引物, 引物序列信息見表 1, 引物于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 RT-PCR引物序列信息Tab.1 RT-PCR primer sequence information

利用RT-PCR研究hsp70和hsp90在中間球海膽各組織中的表達(dá)量, 使用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit (TliRNaseH Plus, TaKaRa)試劑盒, 在 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system(Life Technologies, USA) 上進(jìn)行熒光定量 PCR。20μL反應(yīng)體系為 10μL 2×SYBR Premix ExTaqTMII (TliRNaseH Plus), 0.4μL ROX Reference Dye II, 1μL cDNA 模板, 上下游引物各 0.4μL, ddH2O 補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)程序?yàn)?95°C 30s, 40個循環(huán)的 95°C 5s,60°C 32s;溶解曲線階段 95°C 30s, 60°C 1min , 95°C 15s。以 18SrRNA 為內(nèi)參基因, 采用 2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 通過正態(tài)分布和方差同質(zhì)性檢驗(yàn), 驗(yàn)證各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間有無明顯交互作用后, 單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較用于比較不同樣品的數(shù)據(jù)差異的顯著性,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取結(jié)果及引物篩選結(jié)果

將提取的RNA進(jìn)行RNA完整性檢測, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析, 由圖1可知, 樣品電泳后所得到的條帶顯示28S, 18S條帶清晰, 且28S條帶的亮度明顯高于18S。表明提取的RNA完整性良好,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 海膽部分樣品RNA的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis pattern of RNA 1—6點(diǎn)樣口為海膽樣品

2.2 高溫誘導(dǎo)對海膽不同組織中hsps表達(dá)的影響

在高溫誘導(dǎo)過程中, 以hsp70和hsp90基因在海膽各組織中 0時刻的表達(dá)量作為初始值。hsp70和hsp90在海膽的管足、體腔細(xì)胞和腸組織中的表達(dá)趨勢基本相同, 即隨著溫度其相對表達(dá)量迅速升高, 在溫度達(dá)到設(shè)置的最高溫度(29°C)時其相對表達(dá)量也均達(dá)到最大且顯著高于其初始值(P<0.05), 其中在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至6h時, 海膽管足中hsp70和hsp90的相對表達(dá)量分別高于初始值236倍和109倍。

性腺中hsp70的相對表達(dá)量經(jīng)過12h達(dá)到最大值,為106.56;hsp90的相對表達(dá)量經(jīng)過24h達(dá)到最高, 為45.33, 且顯著高于其初始值(P<0.05)?？谄髦衕sp70和hsp90兩基因的相對表達(dá)量均經(jīng)過12h達(dá)到最大值,分別為 145.55和 45.56, 顯著高于其初始值(P<0.05)(圖 2, 圖 3)。

圖2 中間球海膽不同組織中hsp70的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of hsp70 in different tissues of S.intermedius

圖3 中間球海膽不同組織中hsp90的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of hsp90 in different tissues of S.intermedius

2.3 高溫誘導(dǎo)對中間球海膽不同家系中hsps表達(dá)的影響

圖4為中間球海膽耐熱家系和對照家系中hsp70基因的熒光定量表達(dá)結(jié)果, 各組以0h的hsp70表達(dá)量作為初始值。在實(shí)驗(yàn)過程中, 耐熱家系(2013Si1-1,2013Si7-2, 2013Si13-2)和對照家系(2013SiC-3,2013SiC-5, 2013SiC-6)中hsp70的表達(dá)趨勢基本相同,從適宜水溫 19°C(0h)升至 29°C(3h)的過程中,hsp70的相對表達(dá)量均逐漸升高并在29°C時出現(xiàn)最大值(分別為 329.75、97.29、239.31、230.02、120.51、194.75),且顯著高于其初始值(P<0.05)。在0h、1.5h、6h、24h和48h, 6個家系之間hsp70基因的相對表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。在3h耐熱家系2013Si7-2和對照家系2013SiC-5, 耐熱家系 2013Si13-2和對照家系2013SiC-3之間hsp70基因的相對表達(dá)量顯著不顯著(P>0.05)。在溫度維持在29°C的過程中hsp70的相對表達(dá)量逐漸下降, 且在隨后的溫度逐漸自然回落的過程中,hsp70的相對表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的下降并在實(shí)驗(yàn)開始后48h(19°C)降至接近初始值。

高溫誘導(dǎo)對中間球海膽hsp90基因表達(dá)的影響如圖5所示, 其中各組以0h的hsp90表達(dá)量作為初始值。在實(shí)驗(yàn)過程中,hsp90的相對表達(dá)量均有不同程度的增加, 各組達(dá)到最大值的時間點(diǎn)不同, 并且隨著溫度的變化其表達(dá)趨勢也不同。hsp90在這6組中均隨著溫度而升高, 雖然每組hsp90的相對表達(dá)量達(dá)到最大值的時間點(diǎn)有差異, 但三個耐熱家系和一個對照家系(2013SiC-5)的相對表達(dá)量的最大值均顯著高于其初始值(P<0.05)。由圖 5可看出, 耐熱家系在高溫誘導(dǎo)過程中,hsp90的相對表達(dá)量增加的速率明顯快于對照家系, 且耐熱家系(2013Si1-1和 2013Si7-2)在12h的相對表達(dá)量顯著高于對照家系(2013SiC-3和2013SiC-6) (P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)開始后48h(19°C), 6個家系中hsp90的相對表達(dá)量均降至接近初始值。

圖4 中間球海膽不同家系中hsp70基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of hsp70 in different chains of S.intermedius

圖5 中間球海膽不同家系中hsp90基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of hsp90 in different chains of S.intermedius

3 討論

3.1 高溫誘導(dǎo)對中間球海膽不同組織中hsps表達(dá)的影響

熱休克蛋白作為分子伴侶與胞內(nèi)多肽形成復(fù)合物, 有助于蛋白質(zhì)折疊、防止蛋白質(zhì)聚集和胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸, 滿足細(xì)胞最基本的生存功能(Prattet al,2003)。本研究對中間球海膽hsp70和hsp90基因的組織特異性表達(dá)進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明, 所檢測的5個不同組織(管足、體腔細(xì)胞、腸、性腺和口器)中均有hsp70和hsp90的表達(dá)。在正常條件下, 海膽能合成hsp70和hsp90。

以往對hsp70和hsp90基因在生物體不同組織中的表達(dá)也有研究報道。周鑫等(2013)報道了草魚熱休克蛋白組織特異性表達(dá)與不同組織對溫度變化的敏感和耐受程度有關(guān); 黃桂菊等(2007)研究高溫刺激合浦珠母貝不同組織中熱休克蛋白hsp70的表達(dá)量, 結(jié)果顯示,hsp70的表達(dá)量大小依次為鰓、消化腺、外套膜、閉殼肌、性腺; 韓俊英等(2011)通過 RT-PCR對hsp70在脊尾白蝦的肝胰腺和肌肉中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),溫度引起該基因的高表達(dá), 且在肝胰腺中的高表達(dá)時間相對肌肉較早, 肝胰腺脅迫比肌肉較敏感。本研究結(jié)果顯示, 當(dāng)溫度升高后, 海膽hsp70基因在各組織中的表達(dá)均發(fā)生了變化, 由圖2和圖3可知,hsp70和hsp90在口器和性腺中的表達(dá)趨勢不同于管足、體腔細(xì)胞和腸, 且hsp70和hsp90的相對表達(dá)量也明顯低于后三者, 與黃桂菊等(2007)和韓俊英等(2011)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似, 推測hsp70和hsp90在中間球海膽的管足、體腔細(xì)胞和腸三種組織中優(yōu)先轉(zhuǎn)錄和表達(dá), 可見各組織對高溫產(chǎn)生應(yīng)激的次序和程度存在差異。

3.2 高溫誘導(dǎo)對中間球海膽不同家系中hsps表達(dá)的影響

體腔細(xì)胞多用于研究生物體對環(huán)境脅迫的敏感響應(yīng)(Matrangaet al, 2000), 小個體海膽不能提供足量的體腔液, 而海膽的選育工作通常在個體較小的早期進(jìn)行。管足是棘皮動物水管系統(tǒng)的主要組成部分(常亞青等, 2004), 易于獲取, 且可活體取樣, 對海膽傷害較小。本實(shí)驗(yàn)研究了海膽的管足和體腔細(xì)胞中hsp70和hsp90基因的相對表達(dá)量, 結(jié)果顯示這兩個基因在管足和體腔細(xì)胞中的表達(dá)趨勢相似, 且在各個時間點(diǎn)的相對表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。Osovitza等(2005)也曾用管足組織研究了環(huán)境溫度對紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)hsp70表達(dá)的影響。因此本研究以管足作為樣本進(jìn)行海膽耐熱家系和對照家系hsps的相關(guān)研究。

高溫誘導(dǎo)條件下,hsp70和hsp90作為分子伴侶在阻止細(xì)胞凋亡的過程中扮演著不同的角色(Yahara,1998; Mosseret al, 2000; Salehet al, 2000), 因此如果用內(nèi)源hsps作為環(huán)境熱應(yīng)激的指標(biāo), 應(yīng)該將不同類型hsps分開研究。Wang等(2014)報道, 急性熱應(yīng)激和滲透壓脅迫對刺參hsp70、hsp90和sod基因表達(dá)的影響。董云偉等(2008)發(fā)現(xiàn), 刺參的hsp70的表達(dá)量在溫度升高后立即升高; 曲凌云等(2005)報道, 高溫刺激櫛孔扇貝后, 其血淋巴細(xì)胞中hsp70的表達(dá)量逐漸升高。本研究結(jié)果顯示, 海膽耐熱家系和對照家系中hsp70的表達(dá)量在溫度升高過程中逐漸增加, 與兩位研究者的結(jié)論一致, 推測海膽在受到溫度升高刺激時, 機(jī)體迅速合成hsps, 從而可以增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激耐受性以保護(hù)組織細(xì)胞(Matrangaet al, 2002)。

Dong等(2008)指出刺參在 30°C預(yù)處理后, 其耐受性的變化與hsps的變化模式一致。Dubeau等(1998)指出鮭魚(Salmo salar)成活率的提高與hsps水平在熱激后顯著升高有直接關(guān)系。本研究高溫誘導(dǎo)過程中,hsp70基因在海膽耐熱家系和對照家系中的表達(dá)未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05);hsp90在耐熱家系中的相對表達(dá)量增加的速率明顯比對照家系的快, 且在 12h(溫度升至最高的時間點(diǎn))耐熱家系(2013Si1-1和2013Si7-2)的相對表達(dá)量顯著高于對照家系(2013SiC-3和2013SiC-6)(P<0.05); 而在耐熱家系 2013Si13-2中該基因的相對表達(dá)量高于對照家系中2013SiC-5的原因可能是由于本研究的中間球海膽耐熱家系和對照家系的樣本都是從耐熱家系總體和未經(jīng)過篩選的家系總體中隨機(jī)挑選的, 所以兩個總體內(nèi)部的樣本點(diǎn)之間也會存在差異(組內(nèi)方差), 對照家系也會存在潛在的“耐熱家系”。綜上所述,hsp90基因可作為中間球海膽耐熱品系選育的候選指示因子。在后續(xù)的研究中,還將對在高溫誘導(dǎo)條件下hsp70、hsp90基因與海膽活性及死亡率的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證, 為中間球海膽耐熱品系的快速選育提供參考。

3.3 Hsps基因表達(dá)的時序性

hsp70和hsp90這兩個基因的表達(dá)具有時序性,在高溫環(huán)境條件下, 機(jī)體合成熱休克蛋白作為分子伴侶防止變性蛋白被降解(董云偉等, 2008), 并且

hsp70和hsp90對凋亡體形成的不同階段發(fā)揮各自的阻斷作用(Mosseret al,2000; Salehet al, 2000 )。仿刺參經(jīng)熱激72h后hsp70表達(dá)量降至初始值(Donget al,2008; Menget al, 2011)。Roberts等(1997)也指出hsps的表達(dá)具有可塑性, 且與環(huán)境因子有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示,hsp70和hsp90基因在中間球海膽中均出現(xiàn)時序性表達(dá), 性腺中hsp70和hsp90達(dá)到最大值的時間點(diǎn)也不相同,hsp90較hsp70延遲; 在海膽耐熱家系和對照家系中,hsp70基因的表達(dá)量在升溫過程中的3h達(dá)到最大值,hsp90基因的表達(dá)量達(dá)到最高值的時間點(diǎn)不同。說明HSP70和HSP90雖都是熱休克蛋白家族的成員, 但在海膽耐熱誘導(dǎo)過程中響應(yīng)不同。

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