王 昕，戴建軍，吳彩鳳，張樹山，吳鋆龍，張德福

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106； 3.上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106)

豬冷凍精子的細(xì)胞凋亡及凋亡途徑初步研究

王 昕1,2,3，戴建軍1,2*，吳彩鳳1,2，張樹山1,2，吳鋆龍1,2,3，張德福1,2*

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106； 3.上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106)

旨在研究低溫冷凍解凍對(duì)精子細(xì)胞凋亡的影響，并探討凋亡發(fā)生的可能相關(guān)途徑。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)解凍后精子內(nèi)的ROS水平和TUNEL染色后的細(xì)胞凋亡情況，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)精子內(nèi)ATP含量，利用相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同凋亡途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明：冷凍后精子活力、頂體和質(zhì)膜完整率顯著下降(P<0.05)；冷凍精子TUNEL染色后的凋亡率(80.4%)與新鮮組(9.7%)相比顯著升高(P<0.05)；冷凍組精子內(nèi)ROS綠色熒光比率(58.2%)亦顯著高于新鮮組(P<0.05)；與新鮮組0.926 μmol·L-1的ATP濃度相比，冷凍組精子的ATP濃度(0.247 μmol·L-1)則顯著下降(P<0.05)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，冷凍組中TNF-α、Fas、Caspase家族、P53和Bax基因相對(duì)表達(dá)量升高，其中Fas、P53、TNF-α、Caspase-8和Caspase-9等相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；BCL-2、BIRC-5、MnSOD、CuZnSOD和SURVIVN基因相對(duì)表達(dá)量降低，其中BIRC-5、MnSOD、SURVIVN顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明：低溫冷凍解凍會(huì)使豬精子細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的凋亡，死亡受體外源性凋亡途徑和線粒體內(nèi)源性凋亡途徑均可能介導(dǎo)了冷凍后精子的凋亡。

豬；精子冷凍；細(xì)胞凋亡；凋亡途徑

精子冷凍技術(shù)是現(xiàn)代比較常用的輔助生殖技術(shù)，可長(zhǎng)期有效保存有價(jià)值的基因資源，提高種公畜的利用效率和地區(qū)間交流。經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的研究，該技術(shù)的發(fā)展水平已有很大提高，但公豬由于精子結(jié)構(gòu)的特殊性，對(duì)溫度變化特別敏感,導(dǎo)致其抗低溫能力弱于其他動(dòng)物[1]。研究也表明，精漿中的部分成分會(huì)導(dǎo)致豬冷凍精子活力降低甚至死亡[2]，再加上豬每次射精和輸精量均較大，現(xiàn)有的豬精液冷凍技術(shù)仍不能完全滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求，因此對(duì)冷凍導(dǎo)致的豬精子損傷機(jī)理研究顯得尤為迫切。

線粒體內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體外源性凋亡途徑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的兩個(gè)主要途徑。所有的凋亡途徑都是半胱天冬酶和天冬氨酸參與的復(fù)雜過(guò)程[3-5]。線粒體內(nèi)源途徑主要通過(guò)活化Caspase-9，激活Caspase-3而產(chǎn)生Caspase的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)；死亡受體外源途徑，影響因子主要包括Fas和TNF等，產(chǎn)生有活性的Caspase-8激活下游Caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)。兩個(gè)途徑的共同參與凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，引起細(xì)胞嚴(yán)重凋亡。豬精子冷凍后細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象已有所報(bào)道，但冷凍介導(dǎo)的豬精子細(xì)胞凋亡途徑研究則相對(duì)較少，本文通過(guò)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)與ATP水平檢測(cè)衡量線粒體功能，相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同凋亡途徑中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量，進(jìn)而分析低溫冷凍解凍豬精子的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，確定介導(dǎo)豬精子細(xì)胞凋亡的主要途徑，為日后進(jìn)一步提高冷凍效率提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 精液采集

精液采集于上海白豬(農(nóng)系)原種場(chǎng)。經(jīng)HARMONY稀釋液等溫1∶1稀釋之后，17 ℃保存，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。3層濾紙過(guò)濾，檢測(cè)活力，活力≥0.8的精液用于低溫冷凍。試驗(yàn)分別采用3頭上海白公豬進(jìn)行重復(fù)。

1.2 冷凍和解凍液配制

冷凍基礎(chǔ)液(TCG)：葡萄糖1.1 g，檸檬酸1.48 g，Tris 2.42 g，1 mL雙抗，pH7.4，雙蒸水定容至100 mL，0.22 μm濾器過(guò)濾后，置于4 ℃保存。冷凍I液：體積分?jǐn)?shù)80%的TCG液與20%的卵黃液混合均勻。冷凍II液：體積分?jǐn)?shù)91%的冷凍I液與9%的甘油混合。解凍液(BTS)：葡萄糖3.7 g，二水檸檬酸鈉0.6 g，碳酸氫鈉0.125 g，EDTA 0.125 g，氯化鉀0.075 g，1 mL雙抗，雙蒸水定容至100 mL。

1.3 細(xì)管冷凍精液的制作與解凍

用50 mL離心管分裝好的精液，置于17 ℃恒溫冰箱平衡2 h，期間多次上下顛倒混勻，在室溫下800 g離心10 min后，棄上清，取沉淀與冷凍I液1∶1稀釋，置于4 ℃平衡2 h；取出后加入與冷凍I液同體積的冷凍II液，置于4 ℃平衡1 h后，分裝于0.25 mL的細(xì)管中，封口機(jī)封口，用液氮熏蒸法(距液氮面5 cm處熏蒸12 min)處理后，投入液氮保存。解凍時(shí)，將細(xì)管放入62 ℃水中4 s。待其溶解后取出，擦除表面水珠，并剪開(kāi)兩端，1∶1加入事先準(zhǔn)備好的等體積BTS解凍液中，輕輕混勻后，置于17 ℃冰箱中備用。

1.4 精子質(zhì)量檢測(cè)

精子活力檢測(cè)：分別取10 μL新鮮精液和凍融精液于37 ℃預(yù)熱的載玻片上，從液滴一側(cè)蓋37 ℃預(yù)熱的蓋玻片。400×顯微鏡下鏡檢，計(jì)算精子活力。頂體完整性檢測(cè)：考馬斯亮藍(lán)染色后，400×相差顯微鏡下隨機(jī)觀察200個(gè)精子，計(jì)算頂體完整率。質(zhì)膜完整性檢測(cè)：取50 μL精液于1 mL 37 ℃的低滲液中混勻，37 ℃水浴30 min，取10 μL液體于載玻片上，400×相差顯微鏡下鏡檢，計(jì)算質(zhì)膜完整率。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。每200 μL精液加入2 mL 4%的多聚甲醛，置于搖床固定1 h后取出，PBS清洗，每組各加入2 mL 0.1%Triton重懸，冰浴2 min，再用PBS清洗2遍后，加入50 μL TUNEL檢測(cè)液(TdT酶8 μL，熒光標(biāo)記液48 μL混勻)，37 ℃避光孵育1 h后，洗滌殘余TUNEL檢測(cè)液，1 mL PBS懸浮精子，借助熒光顯微鏡初步觀察綠色熒光強(qiáng)度，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率統(tǒng)計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為450～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515～565 nm)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

活性氧ROS試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。將DCFH-DA與PBS按1∶1 000稀釋成為工作液，分別加500 μL工作液與500 μL精子細(xì)胞混合后，避光置于37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育20 min(每3～5 min顛倒混勻1次)。再用PBS洗滌3次，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm)[6-7]。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ATP濃度檢測(cè)

童話大王鄭淵潔說(shuō)：“寫童話，我不如孩子！”童話大王為什么這么說(shuō)呢？大概是因?yàn)殡S著年齡的增長(zhǎng)，人的認(rèn)識(shí)越來(lái)越理性。人越來(lái)越成熟，而童真童趣卻離我們?cè)絹?lái)越遠(yuǎn)。也許，在你三歲的時(shí)候，你會(huì)說(shuō)出“風(fēng)把嗓子哭啞了”這樣的句子，而現(xiàn)在卻只能說(shuō)出“狂風(fēng)怒吼”這樣的成語(yǔ)……想要找回自己的童真童趣，一定有很多辦法。今天老師要介紹的方法就是：在比你更小的小小孩身上去尋找自己的童年。你有三四歲的小弟弟小妹妹嗎？請(qǐng)觀察他們，記錄他們的行為、他們的語(yǔ)言……持續(xù)觀察一些日子，你一定會(huì)有所收獲的。

ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。取新鮮組和冷凍組200 μL精子樣品(調(diào)整精子密度至1.5×105mL-1)，各加入等體積裂解液，充分作用后，離心取上清液100 μL加入等體積ATP檢測(cè)工作液，室溫放置2 s后，立即用luminometer測(cè)定RLU值。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)設(shè)定1.0、0.5和0.1 μmol·L-13個(gè)濃度梯度。

1.8 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

取1 mL精液，用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取(RNAiso Plus，購(gòu)于TaKaRa公司)，RNase free ddH2O溶解RNA，測(cè)OD值為1.8～2.0可用。用FastQuant RT Kit(With gDNA)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(天根生化科技有限公司)，樣品存放于-80 ℃保存待用。

1.9 qRT-PCR

參考NCBI獲得與豬精子凋亡有關(guān)基因的cDNA序列并設(shè)計(jì)引物，GAPDH為內(nèi)參基因。相關(guān)引物信息見(jiàn)表1，用SYBR?GreenI嵌合熒光法(SYBR Premix Ex TaqTMII試劑購(gòu)于TaKaRa公司)進(jìn)行Real Time PCR。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq II(2×) 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX II 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加ddH2O至20 μL體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火34 s(Tm均為55 ℃)，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，退火并收集熒光，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表1 qRT-PCR所需基因引物信息

Table 1 Primer used for qRT-PCR

引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequence上游引物Forwardprimer下游引物ReverseprimerGAPDHCACGATGGTGAAGGTCGGAGTTGACTGTGCCGTGGAACTTTNF?αATTCAGGGATGTGTGGCCTGCCAGATGTCCCAGGTTGCATBIRC?5ACCACCGCATCTCCACATTTTGGGACAGTGGATGAAACCGP53GAACAGCTTTGAGGTGCGTGGCCATCCAGTGGCTTCTTCTBaxGCCGAAATGTTTGCTGACGGCGAAGGAAGTCCAGCGTCCAFasCGTGAGGGTCAATTCTGCTGTCTTGTCTGTGTAATCCTCCCCCCaspase?3CCGAGGCACAGAATTGGACTTTTCAGCGCTGCACAAAGTGCaspase?8AGGCCCTGCTGAAGAAAATCTCCTGTTCTCCCAGACAGTCCCaspase?9AACTTCTGCCATGAGTCGGGCCAAAGCCTGGACCATTTGCBCL?2GGCAACCCATCCTGGCACCTAACTCATCGCCCGCCTCCCTSURVIVNACCACCGCATCTCCACATTTTGGGACAGTGGATGAAACCGCuZnSODGTGCAGGGCACCATCTACTTTCTTGATCCTTTGGCCCACCMnSODCCCAAAGGGGAATTGCTGGAAACAAGCGGCAATCTGCAAG

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行多重分析，以P<0.05為差異顯著。qRT-PCR以GAPDH為內(nèi)參基因，新鮮組和冷凍組各基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 冷凍對(duì)精子活力、頂體和質(zhì)膜完整率的影響

如表2所示，冷凍組與新鮮組精子細(xì)胞相比，精子活力(40.12vs93.20)、頂體完整率(47.00vs83.56)和質(zhì)膜完整率(38.85vs82.41)均顯著降低(P<0.05)。

如圖1所示，綠色熒光顯示精子細(xì)胞凋亡。新鮮組(圖1A)TUNEL陽(yáng)性精子細(xì)胞少，綠色熒光信號(hào)弱，冷凍組(圖1 B)TUNEL陽(yáng)性精子細(xì)胞多，綠色熒光信號(hào)強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖2)數(shù)據(jù)如表3所示，新鮮組精子細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性率為9.7%，冷凍組TUNEL陽(yáng)性率為80.4%，冷凍解凍后精子細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。

表2 冷凍對(duì)精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率的影響

Table 2 Effect of cryopreservation on sperm motility，normal acrosome rate and plasma membrane integrity rate %

同列上標(biāo)不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Means in the same volumn with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).The same as below

表3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TUNEL陽(yáng)性凋亡比例

Table 3 Percentage of TUNEL positive apoptosis spermatozoa by FCM analyses(%±SEM)

組別GroupsTUNEL陽(yáng)性TUNELpositiveTUNEL陰性TUNELnegative新鮮組Freshgroup9．7±1．5a90．3±1．5a冷凍組Freezinggroup80．4±6．1b19．8±6．1b

2.3 冷凍對(duì)精子內(nèi)ROS水平的影響

如圖3所示，設(shè)置新鮮組為陰性對(duì)照(圖3左曲線)，比較冷凍組(圖3右曲線)中ROS綠色熒光陽(yáng)性比率。結(jié)果顯示與陰性對(duì)照相比，冷凍組ROS綠色熒光比率(58.2%±1.27%)顯著升高(P<0.05)。

2.4 冷凍對(duì)精子內(nèi)ATP濃度的影響

一定范圍內(nèi)的熒光產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)ATP濃度成正比，可得出細(xì)胞內(nèi)ATP濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。測(cè)得樣品的RLU值后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算新鮮組和冷凍組細(xì)胞的ATP濃度，冷凍組ATP濃度(0.247±0.04 μmol·L-1)與新鮮組(0.926±0.19 μmol·L-1)相比顯著降低(P<0.05)。

2.5 豬精子細(xì)胞與凋亡有關(guān)基因mRNA實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

采用GAPDH基因作為管家基因，新鮮組各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均以1表示，比較冷凍組各凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果表明(圖5)，與新鮮組相比，冷凍組BCL-2，CuZnSOD基因的相對(duì)表達(dá)量降低，MnSOD、SURVIVN、BIRC-5基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；冷凍后精子Bax、Caspase-3等基因相對(duì)表達(dá)量升高，TNF-α、P53、Fas、Caspase-8、Caspase-9等基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

A.新鮮組;B.冷凍組.綠色熒光表示TUNEL陽(yáng)性，不發(fā)光表示TUNEL陰性A.Fresh group;B.Freezing group.Green fluorescent show TUNEL positive and no fluorescent show TUNEL negative圖1 熒光顯微鏡下精子的TUNEL染色情況 400× Fig.1 TUNEL staining of spermatozoa under fluorescent microscope 400×

A、B.新鮮組檢測(cè)圖;C、D.冷凍組檢測(cè)圖；M1.TUNEL陰性;M2.TUNEL陽(yáng)性A,B.Fresh；C,D.Freezing.M1.TUNEL negative；M2.TUNEL positive圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子凋亡率Fig.2 Dot-plots and histogram analysis of spermatozoa apoptosis rate

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍融精子細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.3 Histogram analysis of ROS levels in post-thawed spermatozoa by FCM

3 討 論

本試驗(yàn)從ATP和ROS水平研究?jī)鋈诰拥木€粒體狀態(tài)，闡述其與精子凋亡之間的聯(lián)系。S.Chatterjee等[8]和C.Ortege-ferrusola等[9]在對(duì)牛和馬的精子超低溫冷凍后發(fā)現(xiàn)，冷凍可以使精子ATP濃度下降，精子發(fā)生“似凋亡”現(xiàn)象。U.Paash等[10]對(duì)人類精子冷凍后發(fā)現(xiàn)，凍精細(xì)胞內(nèi)的ATP含量亦顯著降低。本試驗(yàn)中豬精子冷凍解凍后的ATP濃度亦表現(xiàn)為顯著下降，表明線粒體的功能在凍后受到顯著影響。X.Wang等[11]研究表明，氧化應(yīng)激是造成人類精子發(fā)生凋亡的一個(gè)重要原因。L.K.Thomson等[12]在人類精子冷凍研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍可使精子發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提升細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本研究中，豬精子冷凍后其DCF綠色熒光比率顯著增加，說(shuō)明在冷凍解凍過(guò)程中精子細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS參與了調(diào)控精子細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

G.Martin等[13]和A.M.Brum等[14]在牛和馬精子冷凍過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，凋亡現(xiàn)象主要表現(xiàn)有精子活力喪失，磷脂酰絲氨酸外翻(PS)，Caspase活化，DNA氧化損傷等。本研究豬冷凍組精子細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色后，熒光陽(yáng)性比率顯著增加。表明精子細(xì)胞發(fā)生DNA斷裂，DNA碎片增多，凍融精子細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，與牛[13]和馬[14]方面的研究結(jié)果相一致。

*.P<0.05圖4 冷凍對(duì)豬精子ATP濃度的影響Fig.4 Effect of cryopreservation on ATP concentration of post-thawed spermatozoa

*.P<0.05.1.Fas；2.P53;3.TNF-α;4.Bax;5.BCL-2;6.BIRC-5;7.MnSOD;8.CuZnSOD;9.SURVIVN;10.Caspase-3;11.Caspase-8;12.Caspase-9圖5 新鮮組和冷凍組精子細(xì)胞各基因的mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.5 The expression of mRNA in fresh and freezing groups

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，F(xiàn)as、Bax、P53基因有促進(jìn)凋亡的作用，BIRC-5、BCL-2基因有抑制凋亡的作用，Caspase酶原本身需通過(guò)活化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究TNF-α、Fas、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、P53和Bax基因相對(duì)表達(dá)量升高，BIRC-5、BCL-2基因相對(duì)表達(dá)量降低，其中TNF-α、Fas、P53、Caspase-8和Caspase-9顯著升高，結(jié)果與Y.J.Jeong等[15]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明在精子細(xì)胞凋亡過(guò)程中促凋亡因子的作用增強(qiáng)，抑制凋亡發(fā)生因子的作用能力減弱，最終導(dǎo)致凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，與J.F.Kerr等在其他哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)果基本相似[16]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)能有效清除胞內(nèi)ROS，抑制精子凋亡現(xiàn)象發(fā)生，提升精子活力。與合成SOD直接關(guān)聯(lián)的MnSOD，CuZnSOD和SURVIVN等抗凋亡抗氧化基因廣泛存在于真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜中，本試驗(yàn)中冷凍解凍精子內(nèi)MnSOD、CuZnSOD和SURVIVN等抗凋亡基因相對(duì)表達(dá)量降低，該結(jié)果與前人研究[17-18]一致，說(shuō)明冷凍過(guò)程中線粒體的功能受到明顯抑制，SOD相關(guān)基因表達(dá)下降，無(wú)法有效清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，ATP濃度顯著下降，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著增加，精子嚴(yán)重凋亡。

凋亡信號(hào)通路表明，F(xiàn)as、TNF和相關(guān)Caspase(例如Caspase-8和Caspase-10)參與死亡受體外源性途徑[19]，本研究表明，冷凍后Fas、TNF-α和Caspase-8顯著上調(diào)說(shuō)明冷凍造成的精子細(xì)胞凋亡有外源性途徑的參與。在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑中[20]，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或凋亡信號(hào)能引起細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞色素C作為凋亡誘導(dǎo)因子，能經(jīng)Caspase-9酶原活化并導(dǎo)致下游酶活性放大(例如Caspase-3和8)而參與線粒體內(nèi)源性凋亡。另外BCL-2可以通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放而抑制凋亡，Bax則可以促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放而促進(jìn)凋亡[21]。本研究顯示精子冷凍后線粒體內(nèi)源途徑相關(guān)基因Caspase-9和Caspase-3表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)節(jié)Caspase-9蛋白表達(dá)的抑制凋亡因子BCL-2下調(diào)，促凋亡因子Bax上調(diào)，均提示線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑也參與了凍后精子細(xì)胞的凋亡。C.J.Zeng等[22]研究也與本試結(jié)果相似，表明Fas和BCL-2/Bax等基因的表達(dá)與精子凋亡有非常明顯的相關(guān)性，主要是與Caspase-6/9酶被激活有關(guān)。綜上表明，低溫冷凍解凍過(guò)程中，線粒體內(nèi)源性途徑和死亡受體外源性途徑均介導(dǎo)豬精子細(xì)胞發(fā)生凋亡，兩條通路聯(lián)系起來(lái)擴(kuò)大了凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。本試驗(yàn)通過(guò)研究豬精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)冷凍解凍后發(fā)生的凋亡現(xiàn)象和與凋亡途徑有關(guān)的基因表達(dá)，證明低溫是影響豬凍融精子活力下降的重要因素，初步確定介導(dǎo)凍融精子細(xì)胞凋亡的有效途徑，為日后精子抗凍保護(hù)劑中凋亡抑制劑和抗氧化劑等的添加提供了理論參考。

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(編輯 程金華)

Preliminary Studies on Apoptosis and Apoptotic Pathways of Frozen Boar Spermatozoa

WANG Xin1,2,3，DAI Jian-jun1,2*，WU Cai-feng1,2,ZHANG Shu-shan1,2，WU Yun-long1,2,3，ZHANG De-fu1,2*

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China； 2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106,China；3.DivisionofAnimalGeneticEngineering，ShanghaiMunicipalKeyLaboratoryofAgri-geneticsandBreeding，Shanghai201106，China)

In order to investigate the effects of cryopreservation on boar spermatozoa apoptosis and apoptotic pathway，the flow cytometry was used to detect the apoptosis state and ROS level of boar frozen spermatozoa.ATP content was measured by luminometer，and the mRNA expression level of genes involved in different apoptotic pathways were measured by real-time quantitative RT-PCR method.The results showed that the motility，normal acrosome rate and plasma membrane integrity rate of sperm after freezing were decreased greatly (P<0.05).The TUNEL-positive spermatozoa rate (80.4%) from freezing group were much higher than that of fresh group (9.7%) (P<0.05).The percentage of ROS-positive spermatozoa in freezing group (58.2%) was also obviously higher than that of fresh group (P<0.05).The cryopreservation caused a significant decrease of ATP concentration in freezing group (0.247 μmol·L-1) comparing with fresh group (0.926 μmol·L-1) (P<0.05).qRT-PCR results showed that the relative expression level from promoting apoptosis genes (TNF-α，F(xiàn)as，Caspase，P53 andBax) were up-regulated，and in which the expression ofFas，P53，TNF-α，Caspase-8 andCaspase-9 increased greatly after cryopreservation (P<0.05).The relative expression level from inhibiting apoptosis genes (BCL-2，BIRC-5，MnSOD，CuZnSODandSURVIVN) were down-regulated，and in which the expression ofBIRC-5，MnSODandSURVIVNdecreased greatly (P<0.05).The results indicated that cryopreservation could lead to boar spermatozoa apoptosis.Not only extrinsic death receptor but also intrinsic mitochondrial signaling pathway might play key roles in mediating spermatozoa apoptosis after cryopreservation.

boar；spermatozoa cryopreservation；apoptosis；apoptotic pathway

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.009

2015-01-05

上海市科委農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(123919N0700；133919N1700)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31372315)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014ZX08006-005；2009ZX08006-014B)

王 昕 (1988-)，女，山西太原人，碩士，主要從事動(dòng)物胚胎工程研究，E-mail：winniexin1223@126.com

*通信作者：戴建軍，E-mail：blackman0520@126.com；張德福，E-mail：zhangdefuzdf@163.com

S828.2

A

0366-6964(2015)08-1341-07