林亞秋，徐亞歐，張潤鋒，張 明，左 斌，鄭玉才

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，黃石 435002)

藏雞Chemerin和ChemR23基因時序表達(dá)及其與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性研究

林亞秋1*，徐亞歐1，張潤鋒2，張 明1，左 斌1，鄭玉才1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，黃石 435002)

本試驗旨在闡明藏雞Chemerin及其受體ChemR23基因的組織和時序表達(dá)譜，分析這兩個基因mRNA表達(dá)水平對肌內(nèi)脂肪沉積的影響。以孵化0～210日齡的藏雞為材料，采用RT-PCR方法克隆Chemerin與ChemR23基因，利用熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測兩個基因在不同組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，并將基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，Chemerin與ChemR23基因共同表達(dá)于藏雞所有被檢測的組織中，且Chemerin主要在肝、脂肪、肺和腎等組織中表達(dá)，而ChemR23在脂肪組織中的表達(dá)量最高(P<0.01)。Chemerin與ChemR23在不同發(fā)育階段胸肌和脂肪組織中的表達(dá)無性別差異，均在孵化0日齡的胸肌中表達(dá)水平最高，在154日齡的皮下脂肪組織中表達(dá)水平最高。Chemerin與ChemR23基因在腿肌中的表達(dá)存在性別差異，Chemerin與ChemR23在119日齡母雞腿肌中的表達(dá)水平極顯著高于其他幾個時期(P<0.01)；但Chemerin在0和210日齡公雞腿肌中的表達(dá)水平極顯著高于其他幾個時期(P<0.01)，ChemR23在210日齡公雞腿肌表達(dá)水平最高(P<0.01)。Chemerin與ChemR23 mRNA表達(dá)量與胸肌IMF含量呈正相關(guān)，Chemerin基因mRNA表達(dá)水平與腿肌IMF含量呈負(fù)相關(guān)，ChemR23基因mRNA表達(dá)水平與公雞腿肌IMF含量呈負(fù)相關(guān)，與母雞腿肌IMF含量呈正相關(guān)。研究結(jié)果提示，Chermerin及其受體ChemR23基因可能在藏雞生長發(fā)育過程中對肌內(nèi)脂肪沉積發(fā)揮重要作用，本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明Chermerin及其受體ChemR23基因在藏雞脂肪代謝中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

藏雞；Chemerin；ChemR23；發(fā)育性表達(dá)；肌內(nèi)脂肪含量

隨著生活水平的不斷提高，人們對雞肉品質(zhì)的要求也越來越高。與哺乳動物脂肪沉積不同，禽類脂肪主要來源于肝合成或由腸消化吸收。肉雞脂肪主要沉積在皮下、內(nèi)臟(主要為腹脂、腸胃周圍)以及肌肉等部位[1]。其中，肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)與肉的嫩度、多汁性以及風(fēng)味密切相關(guān)，是影響肉品質(zhì)風(fēng)味的重要因素[2-4]。

動物IMF沉積主要受脂肪細(xì)胞分化和脂代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)控影響[5-10]。趨化素(Chemerin)基因是1997年首次在銀屑病患者的皮膚中發(fā)現(xiàn)[11]、并于2007年確認(rèn)的新的脂肪因子[12]，在脂肪因子家族中具有獨特的地位，參與脂肪細(xì)胞分化與脂代謝[13-14]。ChemR23(又叫CMKLR1)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，在動物體內(nèi)廣泛表達(dá)[15]，是Chemerin的天然受體。除了ChemR23外，還發(fā)現(xiàn)Chemerin的另外兩種孤核受體(Orphan receptor)GPR1和CCRL2[16-17]，但CCRL2卻不能介導(dǎo)Chemerin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是Chemerin的非信號受體。體內(nèi)的Chemerin主要是與其受體ChemR23結(jié)合而發(fā)揮作用[18-19]。正常或病理狀態(tài)(如肥胖)下，Chemerin及其受體在白色脂肪組織的形成過程中發(fā)揮著十分重要的作用[20]。Chemerin基因可通過使脂肪細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2磷酸化，激活激素敏感脂酶(HSL)的生成來促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂解的作用[14]。對3T3-L1前脂肪細(xì)胞Chemerin或ChemR23基因表達(dá)進(jìn)行干擾，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分化的部分抑制、脂質(zhì)積累的減少和脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、adiponectin、perilipin等表達(dá)水平的降低[13]。J.Huang等克隆了豬Chemerin及其兩個受體基因，指出Chemerin可能通過受體GPR1來調(diào)控脂代謝[21]。S.H.Song等分析了Chemerin及其受體ChemR23基因在牛不同組織的分布情況，結(jié)果表明，Chemerin及其受體ChemR23基因在牛的脂肪組織和脂肪細(xì)胞中高表達(dá)[22]。已有的研究主要集中在人、小鼠細(xì)胞系、豬和牛上，而Chemerin及其受體ChemR23基因在禽類，尤其在雞中的表達(dá)特性及其與IMF沉積的關(guān)系尚未見報道。

藏雞是我國青藏高原特有的雞種，其肉質(zhì)具有高蛋白低脂肪、人體必需氨基酸含量較高，肉質(zhì)鮮嫩、并且具有腿肌率高、腹脂率低等特點[23]，備受人們推崇。本研究以藏雞為研究對象，分析Chemerin和ChemR23基因的組織表達(dá)譜及其在不同發(fā)育階段的胸肌、腿肌和脂肪組織中的時序表達(dá)譜，并分析Chemerin和ChemR23基因在肌肉中的表達(dá)水平與IMF沉積的關(guān)系，為揭示Chemerin和ChemR23在藏雞脂肪沉積和肉質(zhì)形成中的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藏雞及樣品的采集 本試驗選擇孵化0、81、119、154和210日齡的健康藏雞，其來自成都益生康健農(nóng)業(yè)有限公司的藏雞養(yǎng)殖基地，位于四川省彭州市的新興鎮(zhèn)獅山村老虎崖。在屠宰之前每組禁食12 h，然后通過放血法屠宰，屠宰后迅速取其右側(cè)胸肌、腿肌和皮下脂肪組織；并同時采集154日齡公母雞的心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌及皮下脂肪等組織。采集的組織樣品用錫箔紙包好，置于液氮內(nèi)帶回實驗室，-80 ℃放置備用。用于測定肌內(nèi)脂肪含量的樣品去除結(jié)締組織后帶回實驗室置于-20 ℃?zhèn)溆谩?日齡的藏雞未測定IMF含量。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶和Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司，Trizol、SYBR?Premix Ex Taq TM (2×)、pMD-19T載體購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒購于Axygen公司，2 ×TaqPCR Master Mix與感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藏雞Chemerin和ChemR23基因克隆測序 按照Trizol試劑盒使用指南提取藏雞皮下脂肪組織總RNA，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。然后取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以O(shè)ligo (dT) 為引物合成cDNA第一鏈。利用Primer Premier5.0軟件，根據(jù)GenBank中預(yù)測的原雞(Gallusgallus)Chemerin(NM_001277476)和ChemR23基因的序列(NM_001282407)設(shè)計PCR引物(表1)。PCR反應(yīng)體系為2×LongTaqPCR Master Mix 12.5 μL、Primer F(10 μmol·L-1) 1.0 μL、Primer R(10 μmol·L-1) 1.0 μL、DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，39 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用DNA回收試劑盒回收1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后的目的條帶，然后連接于PMD-19T載體，轉(zhuǎn)化DH5α后篩選陽性克隆，送生工生物工程上海(股份)有限公司進(jìn)行序列測定。

表1 克隆和熒光定量PCR引物

Table 1 Primers for cloning and quantitative real-time PCR(qPCR)

名稱Name序列(5′?3′)Sequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpProductslength用途UtilizationChemerinChemerinF1：ATGAAGCTGCTGCTGGGCATR1：CTTCCCTTCACTGCACAGCG60．0601克隆ChemR23ChemR23F1：CATGGCGCTTTCCAATTTATR1：TGTTTGTATAAGACCAAGCCCA60．01275克隆ChemerinChemerinF2：GGAGAACAGGAGGAAGCCAGTCR2：TCAGCCTCGTCACGGTGCTT59．0141qPCRChemR23ChemR23F2：ACGCTCCGTGTTTGAGATTGR2：TCACTGAGAGCATTCACCAGC55．2150qPCRGAPDHGAPDHF：CTGCCCAGAACATCATCCCAR：TCCGTCAGGCAGCTCATAG62．0139內(nèi)參

F.正義鏈引物；R.反義鏈引物；GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶

F.Forward primer；R.Reverse primer；GAPDH.Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

1.2.2 藏雞Chemerin和ChemR23基因序列分析 利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定藏雞Chemerin和ChemR23基因的開放閱讀框位置；利用ExPASy(http://www.expasy.org/tools)分析推導(dǎo)蛋白質(zhì)的等電點和分子量；利用SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽序列[24]；利用clustalx1.83和DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對。

1.2.3 藏雞Chemerin和ChemR23基因組織表達(dá)譜 提取154日齡公雞和母雞(公母各3只，共6只)的心、肝、脾、腎、胸肌、腿肌和皮下脂肪總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用qPCR檢測Chemerin及ChemR23基因在藏雞各組織中的表達(dá)差異(引物序列見表1)。PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?Premix ExTaqTM (2×) PCR 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 30 s，55.2～62.0 ℃ 30 s，45個循環(huán)。

1.2.4 藏雞胸肌、腿肌和皮下脂肪中Chemerin和ChemR23基因時序表達(dá)譜 分別提取孵化0、81、119、154和210日齡的健康藏公雞和母雞(每個階段公母各10只，共100只)胸肌、腿肌和皮下脂肪的總RNA，并取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qPCR 檢測Chemerin和ChemR23在不同發(fā)育階段藏雞胸肌、腿肌和皮下脂肪的表達(dá)差異。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.3。

1.2.5 IMF的測定 采用索氏抽提法測定不同階段藏雞胸肌和腿肌(81～210日齡，每個階段公母各15只，共120只)中的IMF含量，按照公式計算IMF含量：

式中，x表示浸提前樣品干重，y表示浸提后的樣品干重。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，基因組織差異定量分析結(jié)果以心的Ct值為對照來計算，不同發(fā)育階段以孵化0日齡為對照，結(jié)果用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計分析[25]。最終結(jié)果以SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗分析，基因的表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)用Bivariate Correlations 進(jìn)行分析。當(dāng)P<0.05 時，表示差異顯著，當(dāng)P<0.01 時，表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 藏雞骨骼肌IMF含量測定

如圖1所示，公雞胸肌IMF隨著日齡增加而呈上升趨勢，但各個階段無顯著差異(P>0.05)；119日齡公雞腿肌IMF含量極顯著高于其他各個階段(P<0.01)。154和210日齡母雞胸肌IMF含量極顯著高于其81和119日齡兩個階段(P<0.01)；154和210日齡母雞腿肌IMF含量極顯著高于81日齡(P<0.01)，顯著高于119日齡(P<0.05)。

IMF在孵化0天沒有測定(表示為0)。IMFbr-male.公雞胸肌肌內(nèi)脂肪含量；IMFbr-female.母雞胸肌肌內(nèi)脂肪含量；IMFth-male.公雞腿肌肌內(nèi)脂肪含量；IMFth-female.母雞腿肌肌內(nèi)脂肪含量；每個性狀n=15.同一性別同一組織不同階段大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示無顯著差異(P>0.05)IMF could not be measured at 0 day (all shown as 0).IMFbr-male.IMF content of breast muscle of male；IMFbr-female.IMF content of breast muscle of female；IMFth-male.IMF content of thigh muscle of male；IMFth-female.IMF content of thigh muscle of female.n=15 for each trait.Different capital letters show significant differences(P<0.01)，different small letters show obvious differences (P<0.05)，no obvious difference is indicated by the same letter (P>0.05)，comparing the IMF contents of the tissues from the chicken with same sex but different ages圖1 藏雞胸肌和腿肌IMF含量Fig.1 IMF in breast and thigh muscle across ages of Tibetan chickens

2.2 藏雞Chemerin和ChemR23基因克隆

本試驗獲得藏雞Chemerin基因序列長601 bp(GenBank登錄號為KP729054)，其中ORF為489 bp，編碼162個氨基酸，與原雞(Gallusgallus)該基因的同源性為100%(圖2A)。獲得藏雞ChemR23 基因序列長1 275 bp(GenBank登錄號為KP729055)，其中ORF為1 083 bp，編碼360個氨基酸，與原雞該基因相似序列的同源性為99%，有4個氨基酸發(fā)生突變(圖2B)。Chemerin蛋白具有信號肽結(jié)構(gòu)，信號肽切割位點在17～18氨基酸，該信號肽區(qū)域在1～17個氨基酸序列。ChemR23無信號肽結(jié)構(gòu)。2.3 藏雞Chemerin和ChemR23基因的組織表達(dá)譜

Chemerin基因在154日齡公雞的肝中表達(dá)最高，極顯著高于其他各個組織(P<0.01)，其次在肺、腎、脂肪和脾組織中表達(dá)水平較高，均極顯著高于其他各個組織(P<0.01)；Chemerin基因在154日齡母雞的脂肪組織中表達(dá)最高，極顯著高于其他各組織(P<0.01)，在肝、肺和腎中有較高水平的表達(dá)，均極顯著高于心、脾、胸肌和腿肌中的表達(dá)水平(P<0.01)(圖3A，3B)。

ChemR23基因在154日齡公雞和母雞的脂肪組織中表達(dá)最高，極顯著高于其他各個組織的表達(dá)水平(P<0.01)，在肺和脾組織的表達(dá)水平次之 (圖3C，3D)。

序列比對采用clustalx1.83 和 DNAMAN軟件來進(jìn)行The alignment was performed with Sequence Alignment by clustalx1.83 and DNAMAN圖2 藏雞Chemerin (A) 及ChemR23 (B)推測的氨基酸序列與原雞氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of the predicted amino acid sequences of Tibetan chickens (A) Chemerin and (B) ChemR23 with Gallus gallus

2.4 藏雞Chemerin和ChemR23基因的時序表達(dá)譜

本試驗依據(jù)所研究雞種的脂肪生長發(fā)育特點選擇0～210日齡藏雞的胸肌、腿肌和皮下脂肪組織，檢測Chemerin和ChemR23基因的時序表達(dá)情況。結(jié)果指出，Chemerin基因在0日齡公雞和母雞胸肌中的表達(dá)水平極顯著高于其他日齡(P<0.01)(圖4A)。Chemerin基因在藏雞腿肌中的表達(dá)存在性別差異，Chemerin基因在公雞孵化0與210日齡的腿肌中的表達(dá)水平極顯著高于其他3個時期的表達(dá)水平(P<0.01)；Chemerin基因在119日齡的母雞腿肌中的表達(dá)水平則最高，極顯著高于其他幾個時期(P<0.01)(圖4B)；Chemerin基因均在154日齡的公雞和母雞皮下脂肪中表達(dá)水平最高，極顯著高于其他幾個時期的表達(dá)水平(P<0.01)(圖4C)。

ChemR23在公雞和母雞胸肌中的表達(dá)趨勢一致，均在0日齡表達(dá)水平最高。在0日齡公雞胸肌中ChemR23表達(dá)水平顯著高于154和210日齡的表達(dá)水平(P<0.05)，在0日齡母雞胸肌的表達(dá)水平極顯著高于其他日齡的表達(dá)水平(P<0.01)(圖4D)。ChemR23在藏雞公雞和母雞腿肌中的表達(dá)規(guī)律卻不同。ChemR23在210日齡的公雞腿肌中表達(dá)水平極顯著高于其他日齡的表達(dá)水平(P<0.01)，在119日齡母雞腿肌中的表達(dá)水平極顯著高于其他日齡(P<0.01)(圖4E)；ChemR23基因在154日齡公雞和母雞皮下脂肪中表達(dá)水平最高，在154日齡公雞脂肪組織中表達(dá)水平極著高于其他日齡(P<0.01)，在154日齡母雞脂肪組織中表達(dá)水平高于81和119日齡，極顯著高于0和210日齡(P<0.01)(圖4F)。

A、B表示熒光定量檢測Chemerin基因在藏雞各組織中的表達(dá)水平；C、D表示熒光定量檢測ChemR23基因在藏雞各組織中的表達(dá)水平。GAPDH作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(n=3)。不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示無顯著差異(P>0.05)The mRNA expression levels of Chemerin (A，B) and ChemR23(C，D) were quantitated in various tissues by qRT-PCR and normalized using GAPDH.Data were presented “mean ±SD” (n=3 for each mean).Different capital letters show significant differences (P<0.01)，different small letters show significant differences (P<0.05)，no obvious difference is indicated by the same letter (P>0.05)圖3 藏雞Chemerin及ChemR23的組織分布Fig.3 Tissue expression of Chemerin and ChemR23 in Tibetan chickens

A、B、C表示熒光定量檢測Chemerin基因在藏雞胸肌、腿肌和脂肪組織中的表達(dá)水平，D、E、F表示熒光定量檢測ChemR23基因在藏雞胸肌、腿肌和脂肪組織中的表達(dá)水平。GAPDH作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(n=10)。同一性別同一組織不同階段大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示無顯著差異(P>0.05)The mRNA expression levels of Chemerin in breast muscle，thigh muscle and adipose tissue(A，B，C) and ChemR23 in breast muscle，thigh muscle and adipose tissue(D，E，F(xiàn)) were quantitated in various tissues by qRT-PCR and normalized using GAPDH.Data were presented” mean ±SD”(n=10 for each mean).Different capital letters show significant differences(P<0.01)，different small letters show obvious differences (P<0.05)，no obvious difference is indicated by the same letter (P>0.05)，comparison were the IMF contents of the tissues from the chicken with same sex but different age圖4 Chemerin及ChemR23在不同發(fā)育階段藏雞3種組織中的表達(dá)水平Fig.4 Chemerin and ChemR23 mRNA expression in 3 tissues of Tibetan chickens at different ages

2.5 藏雞不同肌肉組織Chemerin和ChemR23基因mRNA表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)性

藏雞不同生長發(fā)育階段不同部位肌肉組織基因表達(dá)水平(每個階段公母各10只)與IMF含量(每個階段公母各15只)的相關(guān)分析結(jié)果表明，Chemerin和ChemR23基因在藏雞胸肌各個階段的表達(dá)水平與相對應(yīng)的IMF含量呈不同程度的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可見，Chemerin和ChemR23基因mRNA表達(dá)水平與胸肌IMF含量的相關(guān)性無性別差異，均呈不同程度正相關(guān)，且在公雞上相關(guān)性達(dá)到顯著水平相關(guān)系數(shù)分別為0.347和0.336(P<0.05)，在母雞的相關(guān)系數(shù)分別為0.031和0.173；Chemerin和ChemR23基因mRNA表達(dá)水平與公雞腿肌的IMF含量均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.055和-0.052；Chemerin基因mRNA表達(dá)水平與母雞腿肌IMF含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.031，ChemR23基因mRNA表達(dá)水平與母雞腿肌IMF含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.118。

3 討 論

Chemerin是脂肪因子(Adipokines)的成員之一，在維持機(jī)體平衡中具有多重的重要作用，包括肥胖、糖尿病、代謝綜合征、胰島素抵抗、心血管疾病等[12，19，26-30]。關(guān)于Chemerin和ChemR23的研究主要集中在嚙齒動物和哺乳動物上，在禽類中少有報道。為了揭示Chemerin基因在禽類脂肪沉積中的作用，本試驗克隆獲得藏雞Chemerin及其受體ChemR23的基因序列，發(fā)現(xiàn)藏雞的Chemerin及ChemR23推測的氨基酸序列與NCBI上登錄的原雞氨基酸序列同源性分別為100%和99%，說明同源性極高。并且利用軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Chemerin蛋白具有信號肽結(jié)構(gòu)，但其受體ChemR23則無信號肽序列。

為了闡明Chemerin及其受體ChemR23基因在藏雞脂肪沉積中的作用，本試驗檢測了其在藏雞各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Chemerin及其受體基因在藏雞中的表達(dá)譜與其他動物存在一些相似及不同之處。Chemerin在人體的多種組織廣泛表達(dá)，其中主要表達(dá)于白色脂肪組織、肝和肺[31]。在小鼠中，Chemerin基因在白色脂肪組織、肝和胎盤表達(dá)最高，卵巢次之，其他組織中的表達(dá)約低于肝的5%[32]。Chemerin基因主要在豬的肝、脂肪組織和腎組織中表達(dá)，在肌肉中未檢測到表達(dá)[21]；ChemR23基因主要表達(dá)在豬脾、皮下和附睪的白色脂肪組織，在胃和肺中表達(dá)水平較低[21]。ChemR23在嚙齒類動物肺中表達(dá)水平很高[12，14]，這與本試驗結(jié)果相似。Chemerin基因主要在牛脂肪、肝和腎中高表達(dá)，ChemR23則廣泛表達(dá)于腦、腦垂體、胃、心、肝、肺、腎、骨骼肌和脂肪等組織中[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Chemerin及其受體ChemR23基因廣泛表達(dá)于藏雞包括胸肌和腿肌的各個組織中，其中Chemerin主要在藏雞的脂肪、肝、肺和腎中表達(dá)，ChemR23主要在脂肪組織中表達(dá)，在肺和脾中也存在較高水平的表達(dá)；Chemerin及其受體ChemR23基因在藏雞的不同組織中表達(dá)存在差異的原因推測可能是在某些組織中Chemerin基因發(fā)揮作用是通過其他兩個受體來實現(xiàn)的。綜合多項研究結(jié)果推測，Chemerin與ChemR23基因的組織表達(dá)具有物種特異性。

表2 藏雞Chemerin和ChemR23基因的表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)性分析

Table 2 The correlation ofChemerinandChemR23 gene expressions and IMF content in muscles of different parts in Tibetan chickens

部位Differentpart性別SexChemerin基因mRNAChemerinmRNAexpressionChemR23基因mRNAChemR23mRNAexpression胸肌Breastmuscle公雞r=0．347?(P=0．028)r=0．336?(P=0．030)母雞r=0．031(P=0．434)r=0．173(P=0．172)腿肌Thighmuscle公雞r=-0．055(P=0．386)r=-0．052(P=0．390)母雞r=-0．031(P=0．433)r=0．118(P=0．264)

從本試驗組織表達(dá)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Chemerin及受體ChemR23基因在藏雞皮下脂肪組織中均存在較高水平的表達(dá)，推測可能在皮下脂肪細(xì)胞分化中具有重要調(diào)控作用。因此闡明Chemerin及受體ChemR23基因在皮下脂肪的時序表達(dá)譜具有重要意義，結(jié)果指出Chemerin及受體ChemR23基因在不同發(fā)育階段藏公雞和母雞的皮下脂肪組織中的表達(dá)趨勢一致，具有協(xié)同關(guān)系，推測Chemerin在藏雞脂肪細(xì)胞分化中的作用是通過其受體ChemR23來實現(xiàn)的，且在154日齡時分化水平達(dá)到最高。研究指出，隨著小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3-L1) 分化為成熟脂肪細(xì)胞，Chemerin表達(dá)顯著升高，主要在成熟脂肪細(xì)胞中表達(dá)[12，32]。關(guān)于ChemR23基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)卻有不同的報道，K.Bozaoglu等指出，隨著3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，ChemR23表達(dá)水平下調(diào)[12]；而S.G.Roh等指出，隨著人脂肪細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞分化的進(jìn)行，ChemR23表達(dá)水平與Chemerin基因表達(dá)水平一致，均明顯增加[14]，這與本試驗結(jié)果一致。

前人研究指出，肥胖患者的脂肪組織中Chemerin分泌量顯著高于非肥胖者脂肪組織分泌的量[27]，而且Chemerin基因及受體ChemR23基因可能在女性肥胖中發(fā)揮重要作用[33]，非肥胖個體中Chemerin基因變異與內(nèi)臟脂肪含量的升高顯著相關(guān)[34]，推測該基因作用可能促進(jìn)脂肪沉積，但其是否參與動物IMF沉積尚不清楚。因此為了闡明Chemerin及受體ChemR23基因與藏雞IMF沉積的關(guān)系，本試驗將它們在不同發(fā)育階段藏雞胸肌和腿肌中的mRNA表達(dá)水平與IMF含量進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果表明，Chemerin及其受體ChemR23基因在胸肌和腿肌中的mRNA表達(dá)水平與IMF含量具有一定相關(guān)性，并且在公雞中的相關(guān)性顯著，在母雞中的相關(guān)性不顯著，提示其在藏雞IMF沉積中具有性別特異性。但Chermerin及其受體ChemR23對藏雞IMF沉積的具體作用及機(jī)制需進(jìn)一步試驗驗證。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到藏雞Chemerin及受體ChemR23基因序列，均包含完整的開放閱讀框，GenBank登錄號分別為KP729054和KP729055。Chemerin與ChemR23廣泛表達(dá)于154日齡藏雞各個組織中，其中Chemerin基因主要在肝、脂肪、肺和腎中有較高水平的表達(dá)，ChemR23基因主要在脂肪、肺和脾組織中表達(dá)。Chemerin和ChemR23在不同發(fā)育階段藏雞胸肌和脂肪組織中的表達(dá)無性別差異，但在不同發(fā)育階段藏雞腿肌中的表達(dá)卻存在性別差異。不同部位Chemerin與ChemR23基因mRNA表達(dá)量與IMF含量呈不同程度的相關(guān)性。本試驗為進(jìn)一步研究Chemerin與ChemR23基因在藏雞IMF沉積中的調(diào)控作用提供重要的基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

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(編輯 郭云雁)

Association Analysis of Sequential Expression ofChemerinandChemR23 with Intramuscular Fat Contents in Tibetan Chicken

LIN Ya-qiu1*，XU Ya-ou1，ZHANG Run-feng2，ZHANG Ming1，ZUO Bin1，ZHENG Yu-cai1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China；2.CollegeofLifeSciences，HubeiNormalUniversity，Huangshi435002，China)

This study aimed to clarify the tissue and sequential expression profiles ofChemerinandChemR23 genes in Tibetan chicken，and to investigate the impacts of the 2 genes expressions on intramuscular fat (IMF) deposition.In this study，Tibetan chicken (0-210 day) was used as experimental animals and the RT-PCR method were employed to amplify theChemerinandChemR23 genes.Their relative expression was measured by fluorescent quantitative PCR in various tissues and at different developmental stages.The correlation analysis was performed between gene expression and IMF content.The results indicated that expression ofChemerinandChemR23 was detected broadly in different tissues.Chemerinwas mostly expressed in liver，adipose tissue，lung and kidney of Tibetan chicken， whileChemR23 was expressed in adipose tissue at significantly higher levels than in other tissues (P<0.01).The highest levels were in breast muscle at day 0 and in adipose tissue at day 154，but the expression patterns of the 2 genes in breast muscle and adipose tissue at different developmental stages were not correlated with gender.However，their expression patterns in the thigh muscle were correlated with gender.In female thigh muscle，the relative expression levels of both genes were significantly higher at day 119 than other periods (P<0.01)，but in male thigh muscle，the relative expression level ofChemeringenes were significantly higher at day 0 and 210 than other periods (P<0.01).The peak expression ofChemR23 presented at day 210 in male thigh muscle.The expression ofChemerinandChemR23 mRNA was positively correlated with IMF content in breast muscle，whereasChemerinexpression was negatively correlated with IMF content in thigh muscle.Interestingly，ChemR23 expression was negatively and positively correlated with IMF content of male and female thigh muscle，respectively.The results suggest thatChemerinandChemR23 genes may play critical roles in IMF deposition during growth and development of Tibetan chicken，which will help us to understand the biological functions ofChemerinandChemR23 genes in fat metabolism of Tibetan chicken.

Tibetan chicken；Chemerin；ChemR23;developmental expression；IMF content

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.003

2015-03-23

四川應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2013JY0044)；四川省畜禽育種攻關(guān)項目(2011NZ0099-6)

林亞秋(1976-)，女，內(nèi)蒙古海拉爾人，博士，主要從事動物遺傳育種研究

*通信作者：林亞秋，副教授，E-mail：linyq1999@163.com

S831.2

A

0366-6964(2015)08-1290-10