袁明哲， 陳 姍， 陳嘉偉， 劉其根， 胡夢(mèng)紅

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

有毒銅綠微囊藻脅迫下三角帆蚌消化系統(tǒng)的掃描電鏡觀察

袁明哲， 陳 姍， 陳嘉偉， 劉其根， 胡夢(mèng)紅

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

通過觀察暴露于不同濃度有毒銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)下的三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)的胃、前腸、中腸以及晶桿體等消化系統(tǒng)的掃描電鏡切片，了解有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌消化系統(tǒng)超顯微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)三角帆蚌在濃度為1×107cell/L的有毒銅綠微囊藻環(huán)境下，其晶桿體隨時(shí)間推移而逐漸溶解。在低濃度的銅綠微囊藻環(huán)境下，盡管其會(huì)繼續(xù)濾食，但有毒銅綠微囊藻會(huì)對(duì)其消化系統(tǒng)造成破壞，隨著接觸時(shí)間的增長(zhǎng)，造成其腸道內(nèi)絨毛、纖毛數(shù)量減少，長(zhǎng)度降低，從而降低其消化效率，對(duì)其生長(zhǎng)造成影響。

三角帆蚌；消化系統(tǒng)；有毒銅綠微囊藻；掃描電鏡

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，含氮、磷的廢水排放量不斷增多，水體富營(yíng)養(yǎng)化問題愈加惡化，導(dǎo)致的藻類爆發(fā)式生長(zhǎng)，產(chǎn)生有毒藻類水華。水華爆發(fā)時(shí)，會(huì)在水面形成一層藍(lán)綠色湖靛，同時(shí)散發(fā)出一股腥臭味，不僅使水體含氧量減少導(dǎo)致魚蝦死亡破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)，更對(duì)人和動(dòng)物的飲用水安全造成威脅。目前世界上淡水湖泊藍(lán)藻水華發(fā)生的頻率與嚴(yán)重程度都呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)趨勢(shì)，發(fā)生的地點(diǎn)遍布全球各地，全球約有40%的淡水湖泊存在不同程度的水體富營(yíng)養(yǎng)化[1]。中國(guó)早在20世紀(jì)50年代就已經(jīng)在太湖中發(fā)現(xiàn)有藍(lán)藻水華[2],到20世紀(jì)90年代即有60%以上的天然淡水湖泊有不同程度的富營(yíng)養(yǎng)化污染現(xiàn)象出現(xiàn)[3]。天然水體富營(yíng)養(yǎng)化已成為中國(guó)乃至世界所面臨的重大環(huán)境污染問題之一[1]。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)屬軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，真瓣鰓目，蚌科，在淡水育珠蚌中所產(chǎn)珍珠質(zhì)量極佳，是中國(guó)特有淡水育珠雙殼貝類[4]。其肉質(zhì)鮮嫩，含豐富的蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽和各類維生素，是常見的食物，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。三角帆蚌消化系統(tǒng)分為口、食道、胃、腸和肛門5個(gè)部分[5]。三角帆蚌以浮游生物(主要是浮游植物)為食，其中以綠藻門最多，其次是硅藻門、裸藻門、藍(lán)藻門的藻類[6]，三角帆蚌對(duì)微囊藻屬的濾食率(14.8%)盡管一般，但消化率(63.8%)較高[7]。水華藻類對(duì)水生生物的生態(tài)毒理學(xué)作用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[8-9]。普遍認(rèn)為，有毒水華藻類會(huì)導(dǎo)致魚類的病理癥狀包括肝、腎、鰓、心臟、腦等各種器官的損害[11-12]，進(jìn)而改變魚類的活動(dòng)習(xí)性，使行為異常并最終影響繁殖與存活[10]。然而在三角帆蚌中相似的研究卻鮮見報(bào)道。本研究通過對(duì)比觀察在不同濃度梯度的有毒銅綠微囊藻環(huán)境下的三角帆蚌消化系統(tǒng)的超顯微結(jié)構(gòu)變化，以期為三角帆蚌在水華爆發(fā)初期的飼養(yǎng)及其作為富營(yíng)養(yǎng)化水體治理工具種的可行性研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

一齡三角帆蚌2013年2月購(gòu)自浙江武義三角帆蚌養(yǎng)殖基地，規(guī)格為殼長(zhǎng)(100.73±8.13)mm，濕重(96.61±12.41)g。蚌取回后清洗蚌殼表面的附著物，選取150只健康蚌放入400 L的水族箱中進(jìn)行暫養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)用水為曝氣后的過濾自來(lái)水，每日向其投喂喜食的小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。實(shí)驗(yàn)開始前48 h將蚌轉(zhuǎn)移到清水中，并停止進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)藻類購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。在BG11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，篩選并配制最佳的培養(yǎng)基于光照振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前，對(duì)藻類進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，當(dāng)其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)管理

本實(shí)驗(yàn)測(cè)試有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌的影響，分為有毒銅綠微囊藻處理組(濃度為1 x 107cell/L)和對(duì)照組(僅投喂1 x 107cell/L小球藻)2個(gè)組別，且每個(gè)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)對(duì)應(yīng)1個(gè)5000 mL的大燒杯，每個(gè)燒杯放置6只實(shí)驗(yàn)蚌。實(shí)驗(yàn)選用規(guī)格相似的36只三角帆蚌。試驗(yàn)周期為14 d，于實(shí)驗(yàn)開始(第0天)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第14天)進(jìn)行取樣，每次每個(gè)重復(fù)組取一個(gè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 組織取樣

割斷活體三角帆蚌閉殼肌處以打開蚌殼，從每個(gè)蚌中準(zhǔn)確取出其腸、胃、前腸的一部分以及整個(gè)晶桿體。取下后先用8.5%的生理鹽水反復(fù)沖洗，再轉(zhuǎn)入2.5%的戊二醛中固定并做好標(biāo)記，并于4℃下保存。

1.4 掃描電鏡觀察

將三角帆蚌組織樣品從2.5%的戊二醛固定液中取出，轉(zhuǎn)入50%、70%、90%以及100%這4個(gè)濃度梯度的酒精中逐級(jí)脫水15 min。通過導(dǎo)電膠將脫完水的組織樣品固定到載物盤上，離子濺射鍍膜法噴金，放入掃描電鏡中觀察其超顯微組織并照相。

2 結(jié)果

2.1 有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌晶桿體的影響

晶桿為一支細(xì)長(zhǎng)的幾丁質(zhì)的棒狀物，呈綠色透明狀，長(zhǎng)約5cm，最寬處直徑約2 mm位于晶桿囊中。近胃腔的頭頸部膨大(圖1-1)而后是逐漸變細(xì)桿狀的尾部(圖1-2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在有毒銅綠微囊藻組中的三角帆蚌晶桿囊中均未找到晶桿體，而無(wú)微囊藻組中三角帆蚌的晶桿體正常。

圖1 三角帆蚌晶桿體結(jié)構(gòu)

1—實(shí)驗(yàn)開始前的晶桿體頭部(標(biāo)尺 300 μm)；2—實(shí)驗(yàn)開始前的晶桿體尾部(標(biāo)尺300 μm)。

圖2 三角帆蚌前腸結(jié)構(gòu)

1—實(shí)驗(yàn)開始前的前腸纖毛(標(biāo)尺 100 μm)；2—實(shí)驗(yàn)開始前的前腸絨毛(標(biāo)尺 20.0 μm)；3—微囊藻組的第14天前腸(標(biāo)尺20.0 μm)；4—無(wú)微囊藻組的第14天前腸(標(biāo)尺 20.0 μm)。

2.2 有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌前腸的影響

前腸由黏膜層黏膜下層組成，在掃描電鏡下可以觀察到大量纖毛(圖2-1)與絨毛(圖2-2)。通過對(duì)三角帆蚌的前腸掃描電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)有毒銅綠微囊藻存在情況下腸道纖毛受損，造成食物泡積留、堆積(圖2-3)，而無(wú)微囊藻組則無(wú)明顯堆積(圖2-4)。

2.3 有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌中腸的影響

三角帆蚌的腸由黏膜層和黏膜下層組成，無(wú)肌肉層，但有少量肌纖維，黏膜層較平滑(圖3-1)，可以看到大量的纖毛(圖3-2)和絨毛(圖3-3)。通過纖毛與絨毛的擺動(dòng)，三角帆蚌得以一路暢通的輸送藻類進(jìn)行消化。無(wú)微囊藻組進(jìn)行第14天取樣時(shí)，其中腸(圖3-4)與第0天相比無(wú)明顯不同(圖3-3)。而微囊藻組則纖毛和絨毛數(shù)量、長(zhǎng)度明顯減少并且多出圓形顆粒狀食物泡(圖3-5)，甚至出現(xiàn)被大量食物泡包裹的情況(圖3-6)。

圖3 三角帆蚌中腸結(jié)構(gòu)

1—實(shí)驗(yàn)開始前的中腸(標(biāo)尺 1.00 mm)；2—實(shí)驗(yàn)開始前的中腸纖毛(標(biāo)尺 50.0 μm)；3—實(shí)驗(yàn)開始前的中腸絨毛(標(biāo)尺 20.0 μm)；4—無(wú)微囊藻組的第14天中腸絨毛(標(biāo)尺 20.0 μm)；5—微囊藻組的第14天中腸纖毛(標(biāo)尺100 μm)；6—微囊藻組的第14天中腸(標(biāo)尺 50.0 μm)。

2.4 有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌胃的影響

三角帆蚌的胃呈不規(guī)則囊狀，不同的部位形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定的差異。主要有黏膜層和結(jié)締組織組成的黏膜下層兩部分，肌纖維較少，粘膜層凹凸不平為起伏的溝峪狀(圖4-1)，主要由具有纖毛的柱狀上皮細(xì)胞組成(圖4-2)。在對(duì)胃部掃面電鏡的觀察結(jié)果中，微囊藻組(圖4-3)與無(wú)微囊藻組的實(shí)驗(yàn)組(圖4-4)的胃部無(wú)明顯區(qū)別。

3 討論

瓣鰓綱動(dòng)物消化系統(tǒng)包括消化腺和消化道兩部分。消化腺是指肝胰腺，消化道則包括口、食道、胃和腸。在藻毒素對(duì)消化腺的影響方面，國(guó)內(nèi)外做了較多研究，其中Chung等人[14]研究了暴露于赤潮生物海洋卡盾藻(Chattonellamarina)下翡翠貽貝(Pernaviridis)鰓和肝胰腺的抗氧化應(yīng)答，得出海洋卡盾藻并不能造成翡翠貽貝的抗氧化免疫應(yīng)答；Chen等人[15]則研究了在淺水富營(yíng)養(yǎng)化湖泊微藻肝毒素在淡水貽貝中的富集情況，得出有毒藻類對(duì)貝類的肝胰腺影響最大；相似研究得到Fernandez等人[16]的證實(shí)。

圖4 三角帆蚌胃部結(jié)構(gòu)

1—實(shí)驗(yàn)開始前的胃黏膜層(標(biāo)尺 500 μm)；2—實(shí)驗(yàn)開始前的胃纖毛(標(biāo)尺 20.0 μm)；3—微囊藻組的第14天胃(標(biāo)尺20.0 μm)；4—無(wú)微囊藻組的第14天胃(標(biāo)尺 20.0 μm)。

而有毒藻類對(duì)貝類消化道影響方面的研究則較少。Hegaret等人[17]研究發(fā)現(xiàn)雙殼貝類的軟體組織暴露在有毒藻類中，貝殼會(huì)產(chǎn)生關(guān)閉和限制濾食的行為反饋。金春華、鄭忠明等人[18]研究了有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌耗氧率和排氨率的影響，認(rèn)為三角帆蚌能較好地適應(yīng)低濃度的有毒藻類，但隨著培養(yǎng)水體中有毒藻類含量的增加，其耗氧率明顯增加，同時(shí)由于在高濃度微囊藻毒素影響下三角帆蚌多數(shù)時(shí)間緊閉貝殼，攝食不穩(wěn)定，從而會(huì)造成代謝活動(dòng)異常，導(dǎo)致O∶N異常。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有毒銅綠微囊藻濃度為1×107cell/L的實(shí)驗(yàn)組，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第14天)晶桿體已經(jīng)基本全部消失，這說(shuō)明三角帆蚌進(jìn)入高濃度銅綠微囊藻環(huán)境中，其貝殼可能產(chǎn)生關(guān)閉限制了濾食行為，無(wú)法濾食[13]，使其處于饑餓狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)后期，也確實(shí)觀察到了有毒銅綠微囊藻組貝殼長(zhǎng)期處于關(guān)閉的狀態(tài)，證實(shí)了上述猜測(cè)。

Navarro等人[19]為貽貝短期喂食有毒藻發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的餌料系數(shù)并無(wú)明顯差距。Joana等人[20]研究實(shí)驗(yàn)室條件下紫貽貝對(duì)去毒藻類的吸收與凈化，得出了其對(duì)去毒素有很強(qiáng)的適應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)胃部掃面電鏡的觀察結(jié)果得出有毒銅綠微囊藻對(duì)三角帆蚌的胃部無(wú)大的不良影響，但是腸道中的纖毛與絨毛的密度與長(zhǎng)度明顯較少，以致于無(wú)法像原先一樣依靠纖毛、絨毛的擺動(dòng)來(lái)有效地運(yùn)送食物，造成食物泡大量積留、堵塞。說(shuō)明暴露于有毒銅綠微囊藻環(huán)境中，三角帆蚌將受到一定損傷。其腸道絨毛與纖毛數(shù)量的缺失與長(zhǎng)度的縮短勢(shì)必對(duì)其消化吸收效率造成影響，使其濾食同化效率降低，可能造成其生長(zhǎng)緩慢。這與Joana等人的研究結(jié)果[20]有所不同，可能是因?yàn)樗麄兘o紫貽貝喂食的是去毒藻類，而本實(shí)驗(yàn)中三角帆蚌攝食的是有毒藻類。

綜上所述，在水華爆發(fā)初期即水華藻類濃度并不是很高時(shí)，三角帆蚌盡管其消化系統(tǒng)受到影響，但并不會(huì)影響到其生存。隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化的進(jìn)一步發(fā)展，暴露于有毒水華藻類的時(shí)間延長(zhǎng)，受損的消化系統(tǒng)可能導(dǎo)致三角帆蚌停止生長(zhǎng)甚至死亡。本研究顯示三角帆蚌作為濾食性貝類，可能通過濾食行為改善富營(yíng)養(yǎng)化初期的水體，但是如果在有毒水華藻類中暴露的時(shí)間過長(zhǎng)，其生存難以得到保障，其對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體長(zhǎng)期的治理效果不太理想。

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Scanning electron microscopy observation ofHyriopsiscumingiidigestive system under toxicMicrocystisaeruginosaexposure

YUAN Ming-zhe, CHEN Shan, CHEN Jia-wei, LIU Qi-gen, HU Meng-hong

(College of Life Science and Fisheries, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The ultrastructural changes in the digestive system such as stomach, foregut, midgut, and crystalline style of theHyriopsiscumingiicultured in different concentrations of toxicMicrocystisaeruginosawere observed during the whole experimental period. The results revealed thatH.cumingii′s crystal rod was dissolved due to starvation, when the concentration of microcystis was more than 1 × 107cell/L. ToxicM.eruginosashowed negative effects on the fluff and cilia of the intestine. The figures illustrated that fluff and cilia became fewer and less. Hereby, toxicM.eruginosamight decrease the digestive efficiency ofH.cumingii′s and have negative effects on its growth.

Hyriopsiscumingii; digestive system; toxicMicrocystisaeruginosa; scanning electron microscopy

2014-05-08；

2014-07-30

國(guó)家自然科學(xué)基金(31202015)；上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206)

胡夢(mèng)紅，博士，講師，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)養(yǎng)殖，E-mail: mhhu@shou.edu.cn。

S966.22+1

A

2095-1736(2015)01-0022-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.022