劉 皓, 劉 青, 吳旭干, 何 杰, 董鵬生, 成永旭

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海 201306;2. 上海海洋大學(xué) 上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心，上海 201306)

中華絨螯蟹兩種微衛(wèi)星DNA分型方法的應(yīng)用比較

劉 皓1, 2, 劉 青1, 吳旭干1, 何 杰1, 董鵬生1, 成永旭1, 2

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海 201306;2. 上海海洋大學(xué) 上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心，上海 201306)

為對(duì)比熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳在微衛(wèi)星等位基因分型上的效果，試驗(yàn)選擇6對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)60個(gè)中華絨螯蟹個(gè)體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，熒光標(biāo)記法共檢測(cè)出等位基因129個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)21.5個(gè)等位變異，聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測(cè)出等位基因174個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)29個(gè)等位變異。對(duì)位點(diǎn)Esin67的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記法的重復(fù)率為100%，而聚丙烯酰胺凝電泳法兩次結(jié)果存在較大差異，證實(shí)了熒光標(biāo)記法檢測(cè)的可靠性顯著高于聚丙烯酰胺凝膠電泳。對(duì)兩種方法的檢測(cè)效率和經(jīng)濟(jì)成本的分析表明，熒光標(biāo)記法雖然成本較高，但效率高于聚丙烯酰胺凝膠電泳法。建立單重PCR的多重毛細(xì)管電泳技術(shù)是提高效率、降低成本的有效途徑。

中華絨螯蟹；微衛(wèi)星；PAGE；熒光標(biāo)記；等位基因

微衛(wèi)星又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)(Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP)或短串聯(lián)重復(fù)(Short Tandem Repeats，STR)。微衛(wèi)星標(biāo)記作為一種較為理想的分子標(biāo)記，早在1994年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)在其持續(xù)發(fā)展和管理動(dòng)物遺傳資源的戰(zhàn)略計(jì)劃中, 就將SSR標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具[1]。SSR具有分布廣泛、數(shù)量充足、多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于物種鑒定，種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親權(quán)鑒定、基因定位、基因組作圖、數(shù)量性狀位點(diǎn)解析等領(lǐng)域[2-6]。SSR的技術(shù)路線主要包含4個(gè)步驟：微衛(wèi)星序列的獲得與引物合成，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的檢測(cè)分型，數(shù)據(jù)分析。

在已獲得SSR序列信息轉(zhuǎn)而進(jìn)入大規(guī)模應(yīng)用時(shí)，主要工作量便集中在PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)上，SSR等位基因分型方法的選擇直接決定著工作效率、結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性。SSR等位基因分型的方法有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳、高分辨率熔解曲線(HRM)等，但應(yīng)用最為廣泛的是PAGE和熒光標(biāo)記法[7]。PAGE法因其操作較為簡(jiǎn)單，成本較低，且具有高于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率[8]，被認(rèn)為能夠滿足一般的研究需求，但又存在著工作量大、數(shù)據(jù)收集完全依賴人工、同一板膠的等位基因變異易出現(xiàn)識(shí)別誤差，以及不同批次不同膠片之間數(shù)據(jù)的統(tǒng)一較為復(fù)雜等缺點(diǎn)，往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠可靠[9]。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳具有分析快速、數(shù)據(jù)收集自動(dòng)化、結(jié)果可靠及重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，可以分辨出最低1個(gè)bp的序列長(zhǎng)度差異，因而精確度更高，但因成本較高，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。為了得到更為精確可靠的SSR等位基因信息，很多研究者都選用了熒光標(biāo)記法進(jìn)行等位基因分型[10-11]。然而，有關(guān)PAGE和熒光標(biāo)記法在SSR分型中的重復(fù)性和可靠性的研究，尚未見報(bào)道。

本研究利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)和熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)，選擇6對(duì)SSR引物對(duì)中華絨螯蟹60個(gè)野生個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分型檢測(cè)，以比較兩種分型方法的準(zhǔn)確性以及成本和效率。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用長(zhǎng)江野生中華絨螯蟹成蟹采集自江蘇鎮(zhèn)江江段，雌雄各半，合計(jì)60只，編號(hào)為YW1-60，體重在100～150 g之間。取其附肢肌肉固定于95%乙醇中，-20℃保存。

1.2 DNA提取

采用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(DP324-03，購(gòu)于TIANGEN公司)抽提中華絨螯蟹基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳配合核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)質(zhì)量和濃度，ddH2O稀釋為50 ng/μL待PCR用。

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

從已報(bào)道的中華絨螯蟹SSR引物[12-13]中選擇6對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增效果好的引物分別合成為普通引物和正向5′端熒光標(biāo)記(FAM或HEX)引物(見表1)。10 μL PCR體系包含50 ng 模板，1 μL 10×PCR buffer，200 μM dNTP，各0.5 μM正反向引物，0.5 U Taq 聚合酶，ddH2O補(bǔ)充體積至10 μL(聚合酶、buffer和dNTP均購(gòu)于Takara公司)。降落PCR(Touch-down PCR)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性3 min；93℃變性1 min，56～61℃退火30 s，72℃延伸1 min，共2個(gè)循環(huán)；93℃變性1 min，54～59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共2個(gè)循環(huán)；89℃變性1 min，52～57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；89℃變性1 min，50～55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共20～25個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物-20℃保存待用。

表1 6個(gè)中華絨螯蟹微衛(wèi)星位點(diǎn)的特征

*—熒光標(biāo)記法中的上游引物 5′端加上 FAM或HEX 熒光標(biāo)記。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分型

1.4.1 PAGE檢測(cè)

配制8%的聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)PCR產(chǎn)物的豐度，調(diào)整加樣量，每板凝膠舍去兩端的若干個(gè)加樣孔，僅在中間31個(gè)加樣孔加入DL1000Mraker和PCR產(chǎn)物。300 V電泳80 min?？焖巽y染法步驟如下：1)分離凝膠放入托盤，雙蒸水洗5 min；2)倒掉雙蒸水，加入1‰硝酸銀溶液染色8 min；3)倒掉硝酸銀溶液，加入雙蒸水迅速洗滌2次；4)加入適量顯色液(每1000 mL雙蒸水加入0.5 g碳酸鈉，20 g氫氧化鈉，5 mL甲醛溶液)顯色至條帶清晰可見；5)拍照。用Gel-Pro analyzer-4分析照片，讀取目的條帶的長(zhǎng)度，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft excel中，待下一步分析。

1.4.2 熒光標(biāo)記檢測(cè)

每?jī)蓚€(gè)加入了不同顏色熒光標(biāo)記的位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物混合后，使用甲酰胺變性，以ROX-500作為分子量?jī)?nèi)標(biāo)，使用ABI-3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)分析。GeneMaper-3.5掃描峰圖(見圖1)，讀取目標(biāo)峰所代表的等位基因片段長(zhǎng)度，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft excel中。

圖1 PCR產(chǎn)物混合后的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳與熒光標(biāo)記法檢測(cè)效果比較

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)的依據(jù)是基因庫(kù)中報(bào)道的微衛(wèi)星的重復(fù)類型。使用CONVERT軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Popgene32所需的格式，通過(guò)Popgene32分別得出兩種方法檢測(cè)到的等位基因個(gè)數(shù)(見表2)。在6個(gè)中華絨螯蟹微衛(wèi)星座位中，聚丙烯酰胺電泳共檢測(cè)出174個(gè)等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)29個(gè)；熒光毛細(xì)管電泳則僅檢測(cè)出129個(gè)等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)21.5個(gè)。

表2 兩種分型方法在6個(gè)SSR座位中檢測(cè)出的等位基因數(shù)

圖2 位點(diǎn)Esin67在YW17中擴(kuò)增產(chǎn)物的2次熒光標(biāo)記法檢測(cè)圖譜

Fig 2 Sample YW17′SSR profile of loci Esin67 after two batches capillary electrophoresis detection

選擇SSR位點(diǎn)Esin67的30個(gè)PCR產(chǎn)物，再次分別使用兩種方法進(jìn)行分型檢測(cè)，作為不同批次條件下檢測(cè)結(jié)果的對(duì)照。PAGE法第1次檢測(cè)出的等位變異個(gè)數(shù)為17個(gè)，第2次僅檢測(cè)到13個(gè)等位變異，熒光標(biāo)記法2次檢測(cè)得到的等位變異個(gè)數(shù)均為11個(gè)，每個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果均能重復(fù)(見圖2)。就每個(gè)樣本中先后檢測(cè)到的基因型來(lái)看，在本研究中PAGE檢測(cè)結(jié)果重復(fù)率較低(見圖3和圖4)。

圖3 位點(diǎn)Esin67擴(kuò)增產(chǎn)物的2次PAGE檢測(cè)圖譜

圖4 Esin67 PCR產(chǎn)物2個(gè)批次下PAGE分型結(jié)果

Fig 4 Detection results in loci Esin67 by PAGE of two batches

選取位點(diǎn)Esin67的同一個(gè)PCR產(chǎn)物，在聚丙烯酰胺凝膠多個(gè)點(diǎn)樣孔上樣后進(jìn)行電泳，電泳后讀取條帶，以了解聚丙烯酰凝膠電泳時(shí)同一個(gè)PCR產(chǎn)物在同一板膠中條帶的變異情況(見圖5和圖6)。

圖5 同一PCR產(chǎn)物多個(gè)加樣的PAGE檢測(cè)圖譜

圖6 同一PCR產(chǎn)物的2個(gè)等位基因在同一板膠中顯示的變異

2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳與熒光標(biāo)記法成本及時(shí)效比較

在不考慮儀器購(gòu)置和儀器損耗的前提下，僅就試劑成本來(lái)看，經(jīng)過(guò)計(jì)算，PAGE方法檢測(cè)一個(gè)PCR產(chǎn)物的成本為0.13元，熒光標(biāo)記方法的耗費(fèi)為5.40元(見表3)。在本研究中，熒光標(biāo)記法的試劑成本是PAGE法的數(shù)十倍，其中，熒光引物合成費(fèi)用占成本的大半。

表3 PAGE和熒光標(biāo)記法檢測(cè)360個(gè)PCR產(chǎn)物樣本所需試劑成本

對(duì)大量樣本而言，工作效率也非常重要，試驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法的工作效率差異很顯著。在本研究的實(shí)驗(yàn)流程和實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，以檢測(cè)360個(gè)PCR產(chǎn)物為例，聚丙烯酰胺凝膠電泳從制膠到最終讀出目的條帶長(zhǎng)度耗時(shí)約為14.5 h；熒光毛細(xì)管電泳從樣品前處理到讀出目的片段長(zhǎng)度耗時(shí)約為3.5 h。從時(shí)效上看，本研究中熒光毛細(xì)管電泳的工作效率約為聚丙烯酰胺凝膠電泳的4倍。

3 討論

本研究對(duì)360份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行兩種方法分型比較，得到了一個(gè)有趣的結(jié)果：分辨率較低的PAGE方法檢測(cè)到的等位基因個(gè)數(shù)反而比分辨率很高的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳要多，且在6對(duì)引物中表現(xiàn)出相同的結(jié)果。對(duì)同一批PCR產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，熒光標(biāo)記法具有很強(qiáng)的重復(fù)性，每個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果均能重復(fù)，而PAGE法則重復(fù)率較低，同一個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)不同批次的電泳后顯示出了不同的結(jié)果；以同一個(gè)PCR產(chǎn)物在同一聚丙烯酰胺凝膠上加多個(gè)樣的方式進(jìn)行電泳，則證明了同一等位基因片段在同一板PAGE凝膠上的遷移率也出現(xiàn)一定差異，這就解釋了在本研究中為什么PAGE所檢測(cè)到的等位基因數(shù)量比熒光標(biāo)記法多。結(jié)合以上分析，我們推斷： PAGE法用于SSR等位基因檢測(cè)時(shí)，容易受到凝膠配制和電泳過(guò)程中各種理化條件等因素的影響，同時(shí)量大而繁瑣的目的條帶數(shù)據(jù)讀取和收集工作同樣會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，也增加了不同批次、不同膠板間結(jié)果的不一致性，這樣就會(huì)導(dǎo)致同一等位基因片段在不同批次中檢測(cè)出的片段長(zhǎng)度不同；而熒光標(biāo)記法實(shí)現(xiàn)了SSR等位基因分型的高通量和自動(dòng)化，其檢測(cè)結(jié)果相對(duì)精確和可靠。

當(dāng)面臨大批量樣本的SSR等位基因變異的分型檢測(cè)時(shí)，工作效率是研究者必須要考慮的因素。就本文中檢測(cè)360個(gè)樣本的時(shí)效來(lái)說(shuō)，熒光標(biāo)記法是PAGE法的4倍，而在郝晨陽(yáng)等的研究中[9]，這個(gè)值高達(dá)7.8，這可能是因?yàn)樵跇颖玖扛蟮那橄?，加之多重PCR體系的應(yīng)用，熒光標(biāo)記法能夠節(jié)約更多的時(shí)間和人工成本，凸顯更高的工作效率。

SSR分型成本是評(píng)價(jià)分型方法的一個(gè)重要指標(biāo)。以本研究結(jié)果為例，熒光標(biāo)記法的試劑成本是PAGE法的數(shù)十倍。在許多SSR應(yīng)用的研究中，樣本量足以千計(jì)，而熒光引物合成后可用于更多樣本的PCR擴(kuò)增，這樣就可以有效地減小熒光引物合成對(duì)總成本的貢獻(xiàn)率。但總體來(lái)說(shuō)，熒光標(biāo)記法的使用成本較高，一定程度上限制了這種SSR分型方法的使用。探索一種廉價(jià)高效的SSR檢測(cè)方法，是科研工作者和該技術(shù)廣泛應(yīng)用必需考慮的重要問(wèn)題。多重PCR體系的應(yīng)用對(duì)熒光標(biāo)記法成本的控制及SSR分型的工作效率的提高提供了可能。多重PCR技術(shù)是指在同一PCR體系中同時(shí)對(duì)多對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，需要保證所有引物能夠同時(shí)擴(kuò)增，引物間不能有相互作用，不同SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍不能重疊，產(chǎn)物濃度相當(dāng)?shù)葪l件[14]。然而，多重PCR體系的成功建立是一個(gè)復(fù)雜的摸索過(guò)程，需要大量的前期工作?；诙嘀豍CR方法，單重PCR產(chǎn)物混合后的毛細(xì)管電泳可以大大簡(jiǎn)化PCR體系建立的摸索過(guò)程，只需要將目標(biāo)片段長(zhǎng)度范圍不同的位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，然后進(jìn)入毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測(cè)[15]，可以達(dá)到多重PCR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳相同的效果，是一種有效降低熒光標(biāo)記法成本的簡(jiǎn)便途徑。

綜上所述，熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，分型效果更加高效可靠，為大規(guī)模的SSR標(biāo)記應(yīng)用提供了可能，還可以通過(guò)多重PCR或單重PCR產(chǎn)物混合后電泳以降低分型成本。雖然熒光標(biāo)記法試劑價(jià)格相對(duì)較高，但顯著節(jié)約了人工成本。建立單重PCR產(chǎn)物混合后的毛細(xì)管電泳分型技術(shù)較多重PCR相對(duì)易于實(shí)現(xiàn)，這是提高分型效率、降低成本的有效途徑。在實(shí)際科研工作中，根據(jù)不同物種及等位基因數(shù)量和長(zhǎng)度等具體情況，應(yīng)該綜合考慮結(jié)果可靠性、分型效率和成本等多方面因素，選擇一種合適的SSR等位基因分型方法。

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Comparison of two detection systems of microsatellite markers in the research of Chinese mitten crabs (Eriocheirsinensis)

LIU Hao1,2, LIU Qing1, WU Xu-gan1, HE Jie1, DONG Peng-sheng1, CHENG Yong-xu1,2

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education,shanghia ocean University, Shanghai 201306; 2. Shanghai Universities Knowledge Service Platform Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

360 PCR products of 6 loci among 60 Chinese Mitten Crabs(Eriocheirsinensis)were analyzed by capillary electrophoresis with fluorescent-labeled primers and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), respectively. Total 129 alleles were obtained and 21.5 alleles were detected for every pairs of primers by capillary electrophoresis system, while aggregate 174 and average 29 alleles were detected with PAGE. The repetition rates were at 100% when loci Esin67 was detected for the second time by capillary electrophoresis method, while for PAGE the rates were getting really close to 0, which confirmed that capillary electrophoresis is more reliable than PAGE significantly. More ever, analysis showed that capillary electrophoresis′s material costs and efficiency is higher than PAGE. Establishing a single PCR multiple capillary electrophoresis technology is an effective way to improve efficiency and reduce cost.

Chinese mitten crabs (Eriocheirsinensis); SSR; PAGE; fluorescent-labeled; allele

2014-05-05

2014-06-22

國(guó)家863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 (2012AA10A409-5)；上海市科委科技崇明專項(xiàng) (13231203504)；上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(滬教科2012-62);上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(第二期)項(xiàng)目(滬教科2009-26)

劉 皓,碩士研究生,研究方向?yàn)橹腥A絨螯蟹遺傳育種，E-mail:siyuewuyv @sina.com；

成永旭,博士,教授,研究方向?yàn)榧讱?dòng)物營(yíng)養(yǎng)繁殖，E-mail: yxcheng@shou.edu.cn。

Q959.1;Q343.1+2;S917.4

B

2095-1736(2015)01-0090-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.090