劉冰冰+李穎+樊佳祺+王國夫+孫小紅

摘要：以乙醇作為提取劑制備香榧（Torreya grandis Merrilli）假種皮醇提物，并研究醇提物乳油制劑制備工藝。采用生長速率法測定醇提物及其乳油對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）5種植物源病原菌的抑菌效果。結果表明，香榧假種皮醇提物對番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌等5種植物源病原菌具有較強的抑菌效果，10 mg/mL時對5種病菌的抑制率都在40%以上;篩選出乳油的最佳配方為香榧假種皮醇提物14%、乳化劑（吐溫-20）15%、溶劑（乙酸乙酯）71%，乳油對5種病菌的抑制率都在50%以上。可見香榧假種皮醇提物抑菌譜較廣，值得進一步研究開發(fā)。

關鍵詞：香榧（Torreya grandis Merrilli）假種皮;乙醇提取物;乳油制劑;抑菌活性;植物病原菌

中圖分類號：S482.2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0349-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.023

Antifungal Activities of Ethanol Extracts from Torreya grandis Merrilli Aril and ?Preparation of Emulsifiable Concentrates

LIU Bin-bin，LI Ying，F(xiàn)AN Jia-qi，WANG Guo-fu，SUN Xiao-hong

（Yuanpei College，Shaoxing University，Shaoxing 312000，Zhejiang，China）

Abstract： The antifungal activities of ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril and its emulsifiable concentrates to Alternaria solani， Pyricularia oryzae， Bipolaris maydis，Pseudoperonospora cubensis，F(xiàn)usarium oxysporum f. sp. cucumerinum were tested in vitro. The preparation of emulsifiable solution was studied. The results showed that ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril had strong inhibitory effects on five phytopathogens， with the inhibiting rate of more than 40% at the concentration of 10 mg/mL. The optimal emulsifiable concentrates were ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril 14%， solvent（ethyl acetate） 71%， emulsifying agent （Tween-20）15%. The inhibitive rates of emulsifiable concentrates to five fungi were more than 50%. The ethanol extracts from Torreya grandis Merrilli aril had antifungal activities and were needed to be studied further.

Key words： Torreya grandis Merrilli aril; alcohol extract; emulsifiable concentrates; antifungal activity; phytopathogens

香榧（Torreya grandis Merrilli）為紅豆杉科（紫杉科，Taxaceae）榧屬（Torreya）常綠喬木，系裸子植物，是第三紀孑遺植物，又稱細榧、木皮子、羊角榧等，為稀有堅果類樹種，其果實香榧果具有食用和藥用價值[1，2]。香榧果實一直備受青睞和肯定，但約占其種子鮮重50%～60%的假種皮部分則沒有得到有效利用，長期被當作加工廢棄物，不僅浪費資源，而且污染環(huán)境。

香榧假種皮富含多種活性物質，如黃酮類、二萜類、木脂素類化合物，還有醇、醛、烯、酚等植物芳香物質，某些物質還具有很強的抑菌活性，如木脂素類化合物、烯類化合物等。胡劉巖等[3]研究發(fā)現(xiàn)香榧殼揮發(fā)油含有大量的檸檬烯、蒎烯等具有抑菌作用的活性成分，這可能是其具有抑菌生物活性的原因。然而關于香榧假種皮提取物抑菌活性的研究報道較為鮮見。

植物病害是農業(yè)生產(chǎn)的大敵，而目前防治植物病害的主要手段為施用化學殺菌劑。由于化學農藥有潛在危害，研制開發(fā)與推廣應用安全、高效的生物農藥已成為現(xiàn)代農藥的主流。從植物中尋找抗菌活性物質是目前開發(fā)無公害農藥的重要途徑之一。本研究在測定香榧假種皮乙醇提取物抗菌活性的基礎上，嘗試將其制備成環(huán)保型乳油，旨在為創(chuàng)制和發(fā)展新型植物源農藥提供參考。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?植物樣品 ?香榧假種皮收集自浙江省紹興市稽東鎮(zhèn)香榧基地，經(jīng)紹興文理學院元培學院金自學教授鑒定為Torreya grandis Merrilli 的假種皮，置于陰涼通風處自然陰干。

1.1.2 ?供試菌種 ?黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）由山東省農業(yè)科學院提供。

1.2 ?測定方法

1.2.1 ?醇提物制備 ?將香榧假種皮用中藥粉碎機粉碎，取200 g粉碎物于2 000 mL圓底燒瓶加70%乙醇1 000 mL回流提取2 h，過濾，取濾液旋轉濃縮成浸膏，制成香榧假種皮醇提物，密封后于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?醇提物抑菌活性測定 ?采用菌絲生長速率法進行測定[4，5]。將香榧醇提物浸膏用少量二甲基亞砜溶解，用無菌水定容，配制成各濃度供試藥液。在無菌條件下，將供試菌種用7 mm的打孔器打出一定數(shù)量的菌餅備用。熔化PDA培養(yǎng)基，用移液槍移取0.5 mL藥液放入培養(yǎng)皿內，趁熱倒入14.5 mL培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中制成厚薄均勻的平板，使培養(yǎng)基的藥液最終濃度為2、4、6、8、10 mg/mL，以添加含有同樣濃度的二甲基亞砜的無菌水為對照。每培養(yǎng)皿放置1個菌餅，菌絲面向下，重復3次，（28±1） ℃培養(yǎng)，72 h后用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，評判醇提物抑菌活性。

菌落直徑=菌落測量直徑-菌餅直徑;菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.3 ?醇提物乳油配方確定

1）溶劑篩選。為保證劑型環(huán)保，在乳油溶劑篩選中，棄用三苯類、芳烴類及氯仿等有毒溶劑，選擇毒性相對較低的有機溶劑。取約10 mg的香榧假種皮醇提物浸膏，點于凹形載玻片的凹面內，再用移液槍吸取50 μL的溶劑點于浸膏的一側，加蓋玻片，觀察擴散速度;室溫靜置1 h后，觀察溶解情況。若沒有完全溶解，再滴加10 μL溶劑，再觀察，可逐次滴加溶劑，直至完全溶解。用20倍體視顯微鏡加以確認。為防止溶劑揮發(fā)，可用凡士林密封蓋玻片。所用溶劑有丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、甲醇等。根據(jù)浸膏在溶劑中的擴散速度和溶解度，初步篩選出較佳溶劑。試驗過程中，注意避免空氣流動。

2）乳化劑篩選。棄用農乳系列，選擇毒性相對較低的乳化劑。以醇提物浸膏280 mg，以溶劑篩選確定的溶劑2 mL為基礎，進行乳化劑篩選。觀察所配制劑的外觀，以能形成均相透明、乳化性能好的乳化劑入選。

3）乳油穩(wěn)定性檢測。在250 mL燒杯中，加入10 mL （30±2） ℃標準硬水（氯化鈣0.304 g、六水氯化鎂0.139 g，以蒸餾水定容至1 000 mL）。用移液管吸取適量乳油試樣，在不斷攪拌的情況下慢慢加入硬水中，配成100 mL乳狀液。2～3 r/s攪拌30 s，將乳狀液移到清潔、干燥的100 mL量筒中，（30±2） ℃恒溫靜置水浴1 h，觀察乳狀液分離情況。量筒中無浮油（膏）、沉油和沉淀析出，則判定乳油穩(wěn)定性合格[4]。

4）乳油分散性檢測。將裝有500 mL標準硬水的大燒杯置于25 ℃的恒溫水浴中，溫度平衡后用移液管吸取l mL乳油，離液面1 cm滴下，觀察分散性。如能迅速地自動分散，水體變?yōu)槿榘咨该鳡睿瑒t認為其擴散完全，判定乳油分散性合格。

1.2.4 ?乳油抑菌活性測定 ?按最佳配方配制香榧假種皮醇提物乳油，測定其對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用[6]，測定方法同“1.2.2”。

2 ?結果與分析

2.1 ? 醇提物對植物病原菌的抑制作用

不同濃度的香榧假種皮醇提物對5種供試植物病原真菌菌絲生長均有一定程度的抑制作用（表1），說明其抗菌譜較廣。其中對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制效果最佳，抑制率均在62%以上，在醇提物濃度為10 mg/mL時抑制率最大，為79.57%。對水稻稻瘟病菌和黃瓜霜霉病菌菌絲生長最大抑制效果相近，其中，對水稻稻瘟病菌菌絲生長抑制效果隨醇提物濃度增加而明顯增加，在最大濃度10 mg/mL時，抑制效果最佳，抑制率為68.97%;對黃瓜霜霉病菌菌絲生長抑制效果隨醇提物濃度增加變化不明顯。對玉米小斑病菌，在10 mg/mL和6 mg/mL時的抑制率分別為56.08%和53.83%，2 mg/mL時抑制率在50%以下;對于番茄早疫病菌，抑制率均在50%以下，抑菌效果較差。

2.2 ?醇提物乳油配方篩選結果

香榧假種皮醇提物在各溶劑中擴散速度從快到慢依次為乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇、無水甲醇，溶解度分別為0.14 mg/μL（乙酸乙酯）、0.11 mg/μL（丙酮）、0.07 mg/μL（無水乙醇），0.06 mg/μL（無水甲醇），篩選得到的最佳溶劑為乙酸乙酯。以乙酸乙酯為溶劑進行乳化劑篩選（表2），最終篩選出的最佳乳油配方為醇提物14%、乳化劑（吐溫-20）15%，溶劑（乙酸乙酯）71%。

2.3 ?醇提物乳油對植物病原菌的抑制作用

香榧假種皮醇提物乳油對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用測定結果（表3）表明，10 mg/mL香榧假種皮醇提物乳油對5種供試植物病原真菌菌絲生長均有一定程度的抑制作用。其中對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制效果最佳，抑制率為85.70%;對黃瓜霜霉病菌、番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、水稻稻瘟病菌的菌絲生長抑制率分別為71.92%、50.46%、59.02%、74.49%，其抑菌效果優(yōu)于醇提物。endprint

3 ? 小結與討論

長期以來，香榧假種皮作為廢物丟棄，既浪費了資源，又造成了環(huán)境的污染。已有研究表明，香榧假種皮富含多種活性成分，具有抑菌以及殺蟲生物活性[7，8]。對香榧假種皮采用70%乙醇回流提取活性成分，得到乙醇浸膏，制成不同濃度的溶液，并對其抑菌活性進行了測試。結果表明，不同濃度的醇提物對各供試菌菌絲生長的抑制活性普遍較高，其中對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制效果最佳，各濃度抑制率均在62%以上?？梢姡汩技俜N皮醇提物抑菌譜較廣，且活性較強，具有較好的開發(fā)應用前景。同時也證實香榧假種皮含有抑菌活性化合物，具體成分和作用機理有待深入研究。

乳油是農藥傳統(tǒng)基本劑型之一，與其他農藥劑型相比，乳油有效成分含量較高、貯存穩(wěn)定性好、工藝簡單，至今依然是國內和發(fā)展中國家主要使用的農藥劑型。但由于有機溶劑用量大，容易污染環(huán)境，使用率有所下降。選擇使用環(huán)境友好、生物降解性好、低刺激、高效率的綠色表面活性劑應用于乳油生產(chǎn)，有助于降低助劑對環(huán)境、農產(chǎn)品安全的潛在威脅[9]。本研究對香榧假種皮醇提物浸膏分別通過溶劑和乳化劑的篩選、乳油穩(wěn)定性和分散性的測定，確定最佳配方，制備乳油對其抑菌活性進行測試。結果表明，香榧假種皮醇提物乳油在一定濃度（10 mg/mL）下，對5種供試植物病原真菌菌絲生長均有一定的抑制作用， 且菌絲生長抑制率均高于醇提物?？梢姡?相同提取物含量的乳油抑菌效果更好。這與田秀玲[10]報道的蛇床子乳油比提取液藥效高的結論相符。在開發(fā)新型植物源殺菌劑方面，香榧假種皮醇提物具有較大的潛力， 可對其進行深入研究。

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[10] 田秀玲.植物源殺菌劑——蛇床子乳油的研制[D].沈陽：沈陽農業(yè)大學，2003.endprint