鄭 偉，李珍華，酈丹婷，張 忍，張 瑜，石陸娥

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036)

腸球菌屬于乳酸菌，常見于人體腸道和日常發(fā)酵食品中.20 世紀(jì)初，國外就有學(xué)者開始研究腸球菌的抑菌活性，到目前為止，已有近10 000 篇相關(guān)文獻(xiàn)可在Google Scholar、ScienceDirect 和SpringerLink 等數(shù)據(jù)庫中檢索到.同時(shí)，具有廣譜抑菌作用的腸球菌已被應(yīng)用于食品發(fā)酵和疾病治療等領(lǐng)域，例如，在歐洲，尤其是南歐，含有腸球菌的發(fā)酵劑常常被用于傳統(tǒng)奶酪的生產(chǎn)［1］;在我國，具有腸球菌的混合菌劑則被用于治療動(dòng)物腹瀉和腸道炎癥等疾病［2］.然而，有研究表明腸球菌在一定條件下，可以導(dǎo)致腹瀉、菌血癥、心內(nèi)膜炎和尿道感染等疾病，其應(yīng)用存在一定的安全隱患［3］. 為此，本文結(jié)合國內(nèi)外參考文獻(xiàn)，對(duì)腸球菌抑菌活性物質(zhì)及其安全性進(jìn)行綜述，希望對(duì)腸球菌抑菌活性的研究及其安全使用起到一定的借鑒和指導(dǎo)作用.

1 抑菌活性物質(zhì)

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)腸球菌的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行過大量的研究，發(fā)現(xiàn)腸球菌具有抑菌效應(yīng)，主要是因?yàn)橛袡C(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素和類細(xì)菌素等物質(zhì)的產(chǎn)生.

1.1 有機(jī)酸(Organic acid)

一般認(rèn)為，有機(jī)酸可以通過延長致病菌的代時(shí)以及破壞正常細(xì)胞的膜電位，來使致病菌的生長受到影響，此外，未解離的有機(jī)酸還可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入致病菌的細(xì)胞質(zhì)中，使胞內(nèi)的pH 值降低，同時(shí)胞內(nèi)游離的有機(jī)酸會(huì)進(jìn)一步聚集，使得酸化程度加劇，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡［4］.Anyogu 等［5］從木薯發(fā)酵物中篩選出3株腸球菌，而這3 株菌的代謝產(chǎn)物均能夠抑制致病微生物生長，尤其是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，隨后相關(guān)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這3 株腸球菌的代謝產(chǎn)物之所以具有抑菌效應(yīng)，是因?yàn)橛袡C(jī)酸的產(chǎn)生和積累.

1.2 過氧化氫(Hydrogen peroxide)

在腸球菌的代謝過程中，氧分子會(huì)在黃素蛋白氧化酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH 氧化酶)的作用下形成過氧化氫［6］.形成的過氧化氫可以使細(xì)菌的一些關(guān)鍵酶發(fā)生氧化失活;也可以使細(xì)胞膜中的脂類發(fā)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而改變膜的通透性，導(dǎo)致膜內(nèi)外紊亂;還有可以產(chǎn)生氧自由基，如超氧化物自由基()和氫氧化物自由基(OH·)，來破壞細(xì)菌的DNA，最終起到抑菌的作用［7］.

1.3 細(xì)菌素(Bacteriocin)

1.3.1 細(xì)菌素的定義與分類

隨著研究不斷地深入，人們對(duì)細(xì)菌素的認(rèn)識(shí)也不斷地完善，目前認(rèn)為細(xì)菌素是指某些細(xì)菌代謝過程中，由核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類對(duì)同源或者親緣關(guān)系較近的微生物具有抑制作用的蛋白質(zhì)或多肽［8］.根據(jù)細(xì)菌素的特點(diǎn)不同，可將細(xì)菌素分為以下4 類:Ⅰ類，羊毛硫類抗生素;Ⅱ類，熱穩(wěn)定性小分子肽;Ⅲ類，熱不穩(wěn)定性大分子肽;Ⅳ類，蛋白質(zhì)復(fù)合物.到目前為止，發(fā)現(xiàn)的大部分細(xì)菌素屬于Ⅱ類，這類細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定、耐酸堿、分子量小(大約是30 ～60 個(gè)氨基酸殘基)和通常不經(jīng)過修飾等特點(diǎn)［9］.

1.3.2 細(xì)菌素的合成與分泌調(diào)節(jié)

研究［10］表明，細(xì)菌素的合成與分泌都是從細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長中期開始并一直延續(xù)到穩(wěn)定期，并且該過程受到嚴(yán)格調(diào)控.通常情況下，細(xì)菌素的生產(chǎn)菌會(huì)分泌一種胞外信息素來對(duì)細(xì)菌素的形成進(jìn)行調(diào)控，在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長中期之前，這種信息素的含量很低，不足以啟動(dòng)細(xì)菌素的合成與分泌，但隨著細(xì)菌數(shù)量的增加，胞外信息素的濃度也相應(yīng)提高，直至達(dá)到某一閾值，細(xì)菌素才開始合成并分泌出來.

1.3.3 細(xì)菌素的抑菌譜與抑菌機(jī)理

通常認(rèn)為細(xì)菌素的抑菌譜較窄，只作用于同源或者親緣關(guān)系較近的微生物，然而有些細(xì)菌素除了作用于同源或親緣關(guān)系較近的菌株外，還能對(duì)食物腐敗微生物產(chǎn)生抑制作用［11］.例如細(xì)菌素S37，它不僅可以抑制親緣關(guān)系較近的腸球菌，而且可以抑制李斯特氏菌(Listeria spp.)等腐敗微生物的生長［12］.

關(guān)于細(xì)菌素的抑菌機(jī)理，一般認(rèn)為，細(xì)菌素會(huì)非特異性或特異性地結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜表面上，而后引起一系列的抑菌作用，如:形成細(xì)胞質(zhì)膜離子透性通道，影響膜內(nèi)外質(zhì)子電動(dòng)勢(shì)以及ATP 的合成;破壞蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的合成，造成細(xì)菌新陳代謝的紊亂;引起細(xì)胞膜的穿孔，導(dǎo)致細(xì)菌因胞內(nèi)物質(zhì)的大量泄漏而死亡［13］.

1.3.4 細(xì)菌素的應(yīng)用

目前，細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用方式主要有以下4 種:1)作為新型食品防腐劑應(yīng)用于食品的防腐與保鮮;2)生產(chǎn)微生態(tài)制劑用于人體保健;3)直接添加細(xì)菌素到食品中或以細(xì)菌素產(chǎn)生菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵食品;4)細(xì)菌素柵欄技術(shù)的應(yīng)用.其中，研究最多和開發(fā)最成功的是食品防腐保鮮領(lǐng)域，現(xiàn)在正在開發(fā)和制備包含細(xì)菌素的食品包裝袋和保鮮膜［14］.

細(xì)菌素在動(dòng)物疾病治療中也有一定的應(yīng)用，例如在養(yǎng)殖業(yè)，人們已經(jīng)開始逐步使用細(xì)菌素來替代原始抗生素去預(yù)防和治療動(dòng)物腹瀉等腸道疾?。?5］.盡管這類應(yīng)用才剛剛起步，但迫于新型抑菌物質(zhì)的開發(fā)緩慢以及抗生素耐藥問題的日益嚴(yán)峻等情況，人們正在加快細(xì)菌素應(yīng)用深化的腳步.

1.4 類細(xì)菌素(Bacteriocin like inhibitory substances，BLIS)

類細(xì)菌素比細(xì)菌素具有更為廣闊的應(yīng)用前景，這是因?yàn)榇蟛糠旨?xì)菌素僅僅抑制與其親緣關(guān)系較近的乳酸菌株和非乳酸菌的革蘭氏陽性細(xì)菌，對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌則無效，而類細(xì)菌素不僅可以抑制親緣關(guān)系較近的乳酸菌和革蘭氏陽性菌，而且對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌也有一定的抑制作用［16］.例如侯運(yùn)華等［17］從一株腸球菌SE-81 中分離得到一種類細(xì)菌素物質(zhì)LK-S1，抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該物質(zhì)對(duì)溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌(Escherichia coli)及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等革蘭氏陰性菌都有強(qiáng)烈的抑制作用.

2 安全性

盡管腸球菌具有抑菌作用并被應(yīng)用到食品和疾病治療等領(lǐng)域，但有研究表明腸球菌能夠產(chǎn)生毒性，并引起人體的不適和致病，常見的有腹瀉、菌血癥、心內(nèi)膜炎和尿道感染等［3］.因此，評(píng)估腸球菌的安全性顯得十分重要，這將決定了其能否順利地投入生產(chǎn)和使用.下面從耐藥性和毒力因子兩方面，簡單地介紹一下腸球菌所存在的安全隱患.

2.1 耐藥性(Antibiotic resistance)

耐藥性之所以受到全世界人們的關(guān)注，是因?yàn)榫哂袕V譜耐藥性的菌株將會(huì)導(dǎo)致治療難度的增大、醫(yī)治途徑的減少和診治效果的不佳.早在20 世紀(jì)40年代，人們就發(fā)現(xiàn)青霉素不能夠很好地治療腸球菌所引起的心內(nèi)膜炎，此外，萬古霉素，一種糖肽類大分子抗生素，原本可以有效地對(duì)付多重耐藥性的腸球菌，但由于人們對(duì)萬古霉素的濫用，導(dǎo)致抗萬古霉素的腸球菌出現(xiàn)，從而增加了治療腸球菌相關(guān)疾病的難度［18］.目前，除了發(fā)現(xiàn)抗青霉素和萬古霉素的腸球菌外，還發(fā)現(xiàn)了抗氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素和慶大霉素的腸球菌，幸運(yùn)地是，具有廣譜耐藥性的腸球菌還尚未發(fā)現(xiàn)［19］.關(guān)于腸球菌的耐藥機(jī)理，人們也已經(jīng)做過深入的研究，如表1 所示.

表1 腸球菌耐藥機(jī)理Tab. 1 The antibiotic-resistant mechanisms of enterococci

另外需要注意的是，腸球菌能夠通過耐藥基因的轉(zhuǎn)移，來獲得新型抗生素的抵抗能力，所以，未來的研究方向不能只限于新型抗生素的發(fā)現(xiàn).Arias 等［18］認(rèn)為可以從腸球菌附著和定植胃腸道的機(jī)制出發(fā)，找到新的方法來抑制或減少腸球菌在胃腸道中的定植，也可以與免疫技術(shù)相結(jié)合，研發(fā)出一種綜合性的治療方法.

2.2 毒力因子(Virulence factor)

腸球菌之所以具有安全隱患，還有一個(gè)重要原因，即含有毒力因子(表2).這些毒力因子不僅可以幫助腸球菌附著并破壞宿主細(xì)胞，而且可以對(duì)宿主體內(nèi)的特異性免疫和非特異性免疫產(chǎn)生抵抗作用.

表2 腸球菌的毒力因子Tab. 2 Enterococcal virulence factors

2.2.1 聚合物和腸球菌表面蛋白(Aggregation substance and enteococcal surface protein)

聚合物，是由性信息素質(zhì)粒所編碼形成的，具有粘附作用的細(xì)菌表面蛋白，它呈毛發(fā)狀，并不均勻分布在細(xì)菌表面，在它的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，存在兩個(gè)RGD 序列，該序列可以與真核細(xì)胞表面受體整合素相結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)菌與真核細(xì)胞之間的粘附，同時(shí)，也可以通過纖連蛋白結(jié)合到胞外基質(zhì)中［24］.Chow 等［25］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未感染心內(nèi)膜炎的小兔相比，被感染的小兔體內(nèi)聚合物含量明顯上升，但只有同時(shí)提高聚合物和細(xì)胞溶素(另一種毒力因子)的表達(dá)量，小兔的死亡率才會(huì)上升.這表明在感染致病的過程中，聚合物起到的主要是粘附作用，而致病作用是由細(xì)胞溶素引起的，并且缺少其中的任何一個(gè)都不能引起小兔的死亡.

腸球菌表面蛋白，是由esp 基因編碼形成的高分子量表面蛋白，共含有1 873 個(gè)氨基酸殘基，按照結(jié)構(gòu)和功能的不同，可劃分為4 個(gè)區(qū)域，分別為N 端結(jié)構(gòu)域、核心區(qū)、C 端跨膜區(qū)和錨定域［26］.Heikens 等［27］認(rèn)為在感染致病過程中腸球菌表面蛋白量之所以會(huì)增加，是因?yàn)樵摫砻娴鞍讜?huì)參與粘連宿主細(xì)胞和生物膜形成的過程，而粘連的發(fā)生和生物膜的形成是腸球菌感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，所以隨著感染的發(fā)生，腸球菌表面蛋白的表達(dá)量也就隨之增加.但是，也有學(xué)者對(duì)這點(diǎn)提出了質(zhì)疑，Elhadidy 等［28］發(fā)現(xiàn)esp 基因與生物膜形成之間沒有必然的聯(lián)系，在38 株能夠形成生物膜的腸球菌中，有52.63 %(20/38)的腸球菌是不含有esp 基因的，另外，有2 株腸球菌雖具有esp 基因，但自身卻無法合成生物膜.目前盡管學(xué)者們對(duì)腸球菌表面蛋白的功能機(jī)理仍存在爭(zhēng)議，但可以肯定的是，腸球菌表面蛋白是一種毒力因子，會(huì)參與腸球菌感染致病的過程，同時(shí)機(jī)體也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫抗體，來減少腸球菌表面蛋白的形成［26-27］.

2.2.2 細(xì)胞溶素和明膠酶(Cytolysin and Gelatinase)

細(xì)胞溶素，又稱β-溶血素(β-hemolysin)，是腸球菌具有毒性的一個(gè)重要因素.一般認(rèn)為，細(xì)胞溶素是由革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生的二肽溶解毒素，與lantibiotics 和鏈球菌溶血素S 屬于同一家族，其不論是對(duì)原核細(xì)胞，還是真核細(xì)胞都能夠產(chǎn)生溶解現(xiàn)象［29］.

早在1984年，Ike 等［30］就提出細(xì)胞溶素是一種毒素的觀點(diǎn)，并證實(shí)了細(xì)胞溶素能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生殺傷性.現(xiàn)在關(guān)于腸球菌毒性和細(xì)胞溶素之間的關(guān)系，已在不同的動(dòng)物模型中得到了證實(shí)，如表3 所示.與此同時(shí)，人們還發(fā)現(xiàn)能夠合成細(xì)胞溶素的腸球菌往往也能夠合成聚合物.針對(duì)這一現(xiàn)象，F(xiàn)ranz 等［19］提出了一個(gè)可能性的解釋，即編碼細(xì)胞溶素和聚合物的基因位于同一個(gè)質(zhì)粒上.

表3 腸球菌細(xì)胞溶素在不同動(dòng)物模型中的作用Tab. 3 The effect of the enterococcal cytolysin in different animal models

明膠酶，是由基因gelE 編碼合成的一種分泌蛋白酶，其操縱子frs 是編碼合成的關(guān)鍵因素，即使是在基因gelE 存在的情況下，若frs 缺失或者不完整，明膠酶的合成也會(huì)受到阻礙［34］.

關(guān)于明膠酶的毒性，目前一個(gè)比較公認(rèn)的觀點(diǎn)是，明膠酶會(huì)參與生物膜的形成，同時(shí)，自身也可以降解宿主體內(nèi)的一些重要物質(zhì)，如組織中的明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、內(nèi)皮縮血管肽、血管舒緩肽、抗菌肽和補(bǔ)體等.膠原蛋白和纖維蛋白的降解，會(huì)使得腸球菌離開最初的附著位點(diǎn)轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散到其他敏感性的位點(diǎn);抗菌肽和補(bǔ)體的分解，可以使機(jī)體的免疫系統(tǒng)失效或者破壞［35］.另外需要注意的是，在腸球菌屬的范疇內(nèi)，基因gelE 的分布相當(dāng)廣泛.有數(shù)據(jù)［36］表明，在29 株肉源性腸球菌中，有58.63 %(17/29)的腸球菌具有g(shù)elE 基因，而其他毒力因子的基因分布率都低于50%.

2.2.3 過氧化氫調(diào)節(jié)因子(Hydrogen peroxide regulator)

一些研究表明過氧化氫調(diào)節(jié)因子與腸球菌的毒性是有關(guān)聯(lián)的.它屬于LysR 轉(zhuǎn)錄因子家族，是腸球菌氧化應(yīng)激反應(yīng)中的一個(gè)特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子.在此反應(yīng)中，腸球菌會(huì)產(chǎn)生并分泌抗活性氧的蛋白酶，使得活性氧失活，從而減少機(jī)體中巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞的免疫作用，因此，可以認(rèn)為過氧化氫調(diào)節(jié)因子是有利于腸球菌抵抗機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并提高其在機(jī)體內(nèi)的存活率和致病率［37］. 據(jù)Vernenil 等［38］研究表明，HypR 缺失性突變體，對(duì)過氧化氫高度敏感，也易被巨噬細(xì)胞吞噬消滅，同時(shí)，對(duì)小鼠的毒性也大大降低，與野生型相比，在感染120 h，小鼠的死亡率由100 %降低到了50 %.

2.2.4 莢膜多糖(Capsular polysaccharides)

許多致病微生物都能夠產(chǎn)生莢膜多糖，而莢膜多糖的存在可以幫助致病微生物躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，從而有利于微生物在宿主體內(nèi)的存活.糞腸球菌能夠產(chǎn)生4 種莢膜血清型A，B，C，D，而只有產(chǎn)血清型C 和D 的糞腸球菌，才能夠真正合成莢膜多糖［39］.Thurlow 等［40］表明由9 個(gè)基因(cpsC-cpsK)構(gòu)成的莢膜基因座是莢膜多糖形成的關(guān)鍵，而血清型C 和D 含有上述莢膜基因座的所有基因，并且cpsF 基因決定了血清型C 和D 的特異性.Thurlow 等［41］還認(rèn)為腸球菌的莢膜多糖存在多個(gè)功能機(jī)制，如對(duì)機(jī)體調(diào)理性吞噬的抵抗以及腸球菌表面抗原的隱藏等.在抗體缺乏的情況下，調(diào)理素C3 會(huì)分裂成為C3b，這樣有利于調(diào)理素免疫功能的發(fā)揮，與缺乏莢膜的腸球菌相比，帶莢膜的腸球菌能夠通過抑制C3 和C3b 的積累和識(shí)別，從而有效地抑制機(jī)體的調(diào)理性吞噬;另外，機(jī)體體內(nèi)一般存在著一套免疫監(jiān)控體系，主要是通過病原菌識(shí)別受體(Pathogen recognition receptors，PRRS)來檢測(cè)和識(shí)別致病相關(guān)聯(lián)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而達(dá)到監(jiān)控目的，與腸球菌相關(guān)聯(lián)的PAMPs 是脂磷壁酸，而莢膜多糖的存在可以有效地隱藏腸球菌表面的脂磷壁酸，從而減少PRRS 對(duì)脂磷壁酸的識(shí)別，提高腸球菌在機(jī)體內(nèi)的存活率.

3 結(jié)論與展望

腸球菌能夠產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，如乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素和類細(xì)菌素等，而且不同的腸球菌可以產(chǎn)生不同類型的細(xì)菌素和類細(xì)菌素，因此，發(fā)現(xiàn)新穎并具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌素或類細(xì)菌素是未來研究的主要方向之一.

另外，目前有兩種常規(guī)的方法可以將腸球菌應(yīng)用到日常飲食當(dāng)中:一種是直接將腸球菌加入到待加工的食品中，然后一起培養(yǎng)發(fā)酵;另一種是將純化或者半純化的抑菌物質(zhì)制成藥物或試劑.由于腸球菌有可能產(chǎn)生毒力因子，同時(shí)有可能對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐受性，所以，在直接使用腸球菌之前，需要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，而將腸球菌抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離和純化，則無需考慮腸球菌的安全性問題，因此，分離純化腸球菌抑菌活性物質(zhì)將是另外一個(gè)重要的研究方向.

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