南洋 徐鵬 丁宏 劉莉莉 董輝 馬薇薇

現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

南洋 徐鵬 丁宏 劉莉莉 董輝 馬薇薇

中藥在世界各地得到廣泛使用,西方國家也逐漸選擇中藥作為輔助治療的藥物。然而,中藥存在成分不明確等質(zhì)量和安全問題,阻礙了中藥在國際社會(huì)醫(yī)療保健中的應(yīng)用與普及,這正是前沿的分析技術(shù)急需解決的關(guān)鍵問題,確?？芍貜?fù)識(shí)別和檢驗(yàn)中藥所含的化學(xué)成分。近年來技術(shù)先進(jìn)的分析儀器不斷研發(fā),靈敏度和精確度得到明顯的提高,可采用更高分辨率儀器分析多組分混合物,推動(dòng)中藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)朝著標(biāo)準(zhǔn)化方向進(jìn)行。本文主要綜述分析技術(shù)在中藥材及其提取物質(zhì)量監(jiān)控和鑒定上的最新應(yīng)用。

分析儀器; 中藥材; 色譜指紋圖譜; 超高速液相; 液質(zhì)聯(lián)用; 氣質(zhì)聯(lián)用;多組分

在現(xiàn)代回歸自然的理念引導(dǎo)下,中藥以實(shí)際的療效、豐富的資源、廣泛的分布引起了全世界的關(guān)注[1],但對(duì)于中醫(yī)理論的認(rèn)同仍然有很大的障礙。與西藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)相比,中藥成分過于復(fù)雜,給中藥質(zhì)量監(jiān)控帶來了極大的不便。中藥的傳統(tǒng)劑型是湯劑、膏劑、散劑或丸劑,由于近代制劑技術(shù)的發(fā)展,片劑、栓劑、注射劑等各種劑型不斷出現(xiàn)。然而經(jīng)過配伍組方到形成中成藥的過程中,藥物所含的大量活性成分和它們的相對(duì)濃度會(huì)受到一系列因素的影響,包括藥材種類、基源和生產(chǎn)工藝等[2-5]。這種內(nèi)在化學(xué)成分的多樣性、可變性給分中藥質(zhì)量控制方法帶來了多重的挑戰(zhàn)。近幾年來分析儀器得到長足發(fā)展,在靈敏度的設(shè)計(jì)上取得了迅速進(jìn)展,給含有多組分混合物的中藥以及中藥制劑的分析提供了更高的分辨率?，F(xiàn)在主要的分析技術(shù)包括超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)、二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography,2DLC)、氣象色譜(gas chromatography,GC)、質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)可以單獨(dú)應(yīng)用,但通常串聯(lián)起來使用,對(duì)中藥的質(zhì)量控制作用增強(qiáng),因此本文運(yùn)用具體例子闡明新的關(guān)鍵分析技術(shù)在分析和鑒別中藥方面中的應(yīng)用。

1 色譜分離技術(shù)

1.1 超高效液相色譜

UPLC液體色譜系統(tǒng)可以運(yùn)行在6000～15000 psi的壓力范圍內(nèi),相比于使用較大粒徑柱的高效液相分辨率明顯增加。UPLC最近被證明是在快速色譜分離技術(shù)發(fā)展過程中的最有前景的技術(shù)之一。在實(shí)驗(yàn)中,與傳統(tǒng)高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)相比,UPLC運(yùn)用更少量的溶劑和較少的時(shí)間,特別是UPLC超高的分析速度極大提高大批量樣品的分析效率。有文獻(xiàn)報(bào)道UPLC相比于HPLC有明顯的優(yōu)勢:峰容量是其2倍,速度是10倍,靈敏度增加3～5倍[6]。運(yùn)用更高的柱壓,采用2μm微粒填充柱使其有更高的速度流過固定相,在提高分辨率的同時(shí)減少分析時(shí)間。由于UPLC需要更小填充顆粒的液相色譜技術(shù),通過減小顆粒粒徑來提高通過速度,但是柱壓明顯升高?？偟膩碚f,UPLC顯示出更高的分離效能,高水平的系統(tǒng)穩(wěn)定性,并將其與高度敏感的檢測方法相結(jié)合。UPLC較HPLC更加簡便迅速,既達(dá)到了分析的高通量,得到更高的分析靈敏度,又大大提高了分析速度,減少了有機(jī)溶劑的消耗[7]。它是在HPLC之后使用更加廣泛、高效的分析技術(shù)。UPLC以其高分辨率已經(jīng)完全用于大黃中鞣制和蒽醌類成分的水解后溶出量的快速定量分析[8]。同樣,運(yùn)用UPLC可快速地同時(shí)測定丹參中五種脂溶性成分的含量[9]。色譜指紋圖譜在多組分化學(xué)分析,特別是中藥的化學(xué)成分分析中成為重要標(biāo)準(zhǔn),其中超高效液相色譜法已成功地應(yīng)用于評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地蒼耳子的研究[10]。

1.2 二維液相色譜儀

“峰重疊”是液相色譜誤差來源的重要因素。由于受到分析技術(shù)的限制,相近保留時(shí)間化學(xué)成分的分離問題制約了復(fù)雜樣品中的色譜峰識(shí)別,這一問題在中藥或是方劑的分析中更為顯著。峰重疊雖然可采用連續(xù)不斷的多元檢測方法,但這是一個(gè)非常繁瑣并且代價(jià)很高的解決問題的方案。然而二維、多維分離技術(shù)的出現(xiàn)在分析復(fù)雜的樣品過程中提供了巨大的幫助,可以作為更有效的方法去解決復(fù)雜的問題。在色譜技術(shù)中,現(xiàn)應(yīng)用這種方法主要包括二維氣相色譜、二維液相色譜和各種串聯(lián)質(zhì)譜來來解決多組分峰重疊的問題。全面的二維液相色譜分離是采用多重分離模式和利用所有可用的分辨率,在每一維進(jìn)行分離組分,這種方法可以顯著增強(qiáng)色譜峰的容量,提供良好的靈敏度和強(qiáng)大的分辨率,如果同時(shí)結(jié)合其他探測器分析復(fù)雜的中藥時(shí),可展現(xiàn)更多的優(yōu)勢,尤其是質(zhì)譜檢測器[11]。二維、多維系統(tǒng)利用不同的分離原理可使樣品采用不同維度達(dá)到充分的分離。通過充分利用樣品成分的理化特性,在每一個(gè)維度上都盡量達(dá)到較好的分離效果,在整體上有效降低了樣品的復(fù)雜程度[12]。

2 串聯(lián)色譜技術(shù)

質(zhì)譜是用于識(shí)別從天然產(chǎn)物中提取的未知的化合物時(shí)的檢測器。各種質(zhì)譜儀已經(jīng)與串聯(lián)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于大量的研究中。一般來說,根據(jù)質(zhì)譜各自的分析儀器的準(zhǔn)確性和靈敏度的區(qū)分,可分為高分辨率質(zhì)譜和低分辨率質(zhì)譜。低分辨率質(zhì)譜已成為中藥首選的分析儀器,其優(yōu)點(diǎn)在于容易操作,成本較低且體積較小。高分辨率質(zhì)譜允許識(shí)別目標(biāo)化合物的質(zhì)核比可以達(dá)到低于5 ppm的質(zhì)量誤差,當(dāng)檢測值達(dá)到低于1 ppm時(shí),可以從測得的質(zhì)量數(shù)判定其唯一元素組成。串聯(lián)色譜主要有LC/MS及GC/MS,它允許在中藥樣品中同時(shí)進(jìn)行多成分檢測,而且一次進(jìn)樣可以獲得母離子和碎片離子的信息,通過比較保留時(shí)間、分子量和碎片等信息,可用于中藥檢測和目標(biāo)化合物的識(shí)別。

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)

2.1.1 液相色譜-離子阱質(zhì)普(LC-IT-MS) 離子阱質(zhì)譜儀是先把離子聚集到阱內(nèi),通過低能量碰撞誘導(dǎo)解離,獲得碎片信息,其具有多級(jí)質(zhì)譜功能,對(duì)于解析化合物結(jié)構(gòu)更有優(yōu)勢。高效液相色譜法結(jié)合IT-MS(離子阱質(zhì)譜)在結(jié)構(gòu)解析、碎片的解離行為、母離子的裂解途徑和結(jié)構(gòu)鑒定上優(yōu)勢明顯,例如可以快速鑒定復(fù)方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分,在復(fù)方毛冬青沖劑中鑒定出1種三萜酸和8種三萜皂苷成分,并推測了其它3種可能的三萜皂苷化學(xué)成分[13]。這種多功能的離子肼質(zhì)譜同樣被應(yīng)用于酸棗仁湯中化學(xué)成分的分析,共鑒定了酸棗仁湯中48個(gè)化合物,并對(duì)化合物的藥材來源進(jìn)行了歸屬,首次報(bào)道了方劑中的31個(gè)化合物[14]。

2.1.2 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以運(yùn)用選擇離子檢測(selected reactionmonitoring,SRM)和多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)兩種模式。在MRM模式,色譜分離的優(yōu)化更加簡單,并且母離子和子離子監(jiān)測可提高檢測的特異性和識(shí)別已知分子。重要的是,這種三重質(zhì)譜既有傳統(tǒng)的三重四級(jí)桿的MS/MS掃描、線性離子阱功能,根據(jù)質(zhì)量數(shù)進(jìn)行全掃描分析還可以獲得MS3的數(shù)據(jù)[15]。三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀 (Triple quadrupole trap mass spectrometer, QTrap)在離子阱模式下,QTRAP的MS/MS質(zhì)譜圖的靈敏度比常規(guī)的三重四極桿高出二個(gè)數(shù)量級(jí)以上,同時(shí)還將兩者的掃描功能巧妙的結(jié)合起來,實(shí)現(xiàn)“串聯(lián)四極桿-線性離子阱”的迅速切換。三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(liquid chromatography-triple quadrupole trap mass spectrometer,LC-QTrap-MS)已成功定量和定性識(shí)別出一系列中藥及有效成分(例如北沙參),運(yùn)用LC-QTRAP-MS特有的靈敏度和特異性可研究出北沙參中15種化學(xué)成分[16]。

2.1.3 液相色譜-線性離子阱靜電場軌道阱組合式質(zhì)譜聯(lián)用(LC-LTQ-Orbitrap-MS) 線性離子阱靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(linear ion trap/orbitrap mass spectrometry,LTQ Orbitrap MS)組合軌道阱與線性離子阱,是最新的聯(lián)用儀器,具有所有傳統(tǒng)的MS掃描功能和較高的捕獲能力(利用線性離子阱)和高精密度的質(zhì)量測定(使用的軌道肼),但數(shù)據(jù)采集速率相對(duì)緩慢。采用液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry,LCLTQ-Orbitrap-MS)對(duì)三七化學(xué)成分進(jìn)行定性及定量分析,共鑒定分析了43個(gè)成分,并首次從三七中檢測到新型的三七皂苷母核和乙酰取代皂苷成分[17]。又如運(yùn)用LC-LTQ-Orbitrap-MS分別建立黃芪、三七譜數(shù)據(jù)庫,對(duì)復(fù)方三芪口服液中化學(xué)成分進(jìn)行分離,根據(jù)分子和質(zhì)譜碎片信息,從復(fù)方三芪口服液中分析鑒定了39個(gè)成分[18]。

2.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)

GC-MS/MS具有高靈敏度和強(qiáng)抗干擾能力,是分析、鑒定具有揮發(fā)性成分的首選儀器。快速測定方法用于揮發(fā)油的分析,如對(duì)白豆蔻的指紋圖譜分析[19]。利用GC-MS技術(shù)分析桂枝茯苓丸脂溶性成分的指紋圖譜研究。利用GC-MS發(fā)現(xiàn)二妙丸中5個(gè)未見報(bào)道的揮發(fā)油成分:2-羥基-5-甲基苯乙酮、4, 4-dimethyl-3-( 3-methylbut-3-enylidene )-2-methylenebicyclo[4.1.0]hep-tane;β-沒 藥 醇 (βbisabolol);長葉醛(folicacid);淚杉醇(manool)[20]。

2.3 二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS)

中藥化學(xué)成分復(fù)雜,有的類別差異較大,僅用一種分離手段不能達(dá)到區(qū)分的要求,2DLC將不同的分離方法聯(lián)用,提高對(duì)中藥成分的分離能力,增加色譜的峰容量,建立了用陽離子交換色譜與反相加壓毛細(xì)管電色譜結(jié)合的二維分離平臺(tái),采用三種分離原理分析了中藥材黃柏[21]。

2.4 聯(lián)合在線鑒定技術(shù)

在線分離技術(shù)是鑒定中藥關(guān)鍵成分及復(fù)雜結(jié)構(gòu)的強(qiáng)大工具,對(duì)于進(jìn)一步鑒定帶電粒子的結(jié)構(gòu), MS都可以應(yīng)用。聯(lián)合在線的高效液相串聯(lián)電子噴霧多級(jí)質(zhì)譜(high performance liquid chromatographyelectrospray ionization source/mass spectrometryn, HPLC-ESI/MSn)和離線的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(fourier transform ion cyclotron resonancemass spectrometry,FTICR-MS)技術(shù)能夠快速地對(duì)中成藥進(jìn)行鑒定。例如陳娟娟等[22]運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在線快速識(shí)別與分析了藥用植物通光藤中18個(gè)聚氧孕烷糖苷化合物,通過傅立葉變換離子FTICR-MS離線確定這些化合物的準(zhǔn)確元素組成。

3 結(jié)語與展望

綜上所述,本文探討了UPLC、2DLC、GC、LC-MS等多種分析技術(shù)的特點(diǎn)和原理,根據(jù)其不同特性,采用這些技術(shù)手段作為基礎(chǔ)分析方法,可以識(shí)別和鑒別中藥材真?zhèn)?分離、鑒定中藥成分,并發(fā)現(xiàn)其潛在的毒性。所有這一切都還需要研究者繼續(xù)努力朝著中藥產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、安全、有效的目標(biāo)努力,突破中藥多成分的阻礙,利用液相和質(zhì)譜兩大技術(shù)提高中藥的質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn),為全球人類的健康提供藥材。

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The Review on analysis technique in the evaluation of quality of traditional Chinesemedicine

NANYang,XU Peng,DING Hong et al. College of pharmacy,Heilongjiang university of Chinesemedicine, Haerbin 150040,China

MAWei-wei,E-mail:mawei-wei@163.com

Traditional Chinese medicine(TCM)is widely used in all over the world,and moreand more western countries choose TCM as complementary therapy drugs.However,the quality,the safety and the unclear composition are important problemswhich as a hinder in the popularization and application of Chinesemedicine in the international community health care area.These are the key problems to be resolved in the frontier ofanalysis technology.Repeatable identification chemical composition of TCM could be ensured.With improvements in engineering advanced analytical instruments in recent years,the sensitivity and accuracy have been improved obviously,whichmake themulticomponentmixture analyzed at a higher resolution,and promote the quality control of TCM toward standardization direction.This paper discusses the application of main analytical techniques in TCM,TCM formula and its extract on quality monitoring and evaluation.

Analytical instrumentation; Chinese herbal medicine; Chromatographic fingerprinting; Ultra-performance liquid chromatography; Liquid chromatography coupled tomass spectrometry; Gas Chromatograph coupled to Mass Spectrometry; Multi-componentmixture

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.043

2015-06-11)

(本文編輯:董歷華)

2014年哈爾濱應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(2014RFQXJ1162),2013年度黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金面上項(xiàng)目(201307,201316)

150040 哈爾濱,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(南洋、劉莉莉、董輝、馬薇薇);遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院(徐鵬);山西仟源制藥股份有限公司(丁宏)

南洋(1983-),女,碩士,講師。研究方向:藥物代謝與質(zhì)量研究。E-mail:nancy_you530@sina.com

馬薇薇(1980-),女,博士,副教授。研究方向:藥用植物資源開發(fā)利用。E-mail:mawei_wei@ 163.com